肌內(nèi)磷脂酶在傳統(tǒng)板鴨加工中對磷脂的降解作用研究.pdf

1、腌臘肉制品不但擁有悠久的歷史，而且具有濃郁的臘香風(fēng)味、柔韌的質(zhì)感和良好的耐藏性。涉及臘香風(fēng)味的生化反應(yīng)錯綜復(fù)雜，其形成機(jī)理尚未完全闡明，但大量研究證實(shí):肌內(nèi)脂類物質(zhì)（特別是磷脂）中不飽和脂肪酸的解離、氧化及氧化產(chǎn)物的進(jìn)一步反應(yīng)，是形成臘香風(fēng)味的主要原因。因此，肌內(nèi)磷脂的酶解與腌臘肉制品風(fēng)味關(guān)系密切。本論文以板鴨為對象，首先從肌內(nèi)磷脂所處的肌肉內(nèi)環(huán)境入手，檢測板鴨加工過程中主要理化指標(biāo)，了解可能影響肌內(nèi)磷脂酶解作用的外在因素;同時跟蹤加工

2、中磷脂酶A2和磷脂酶C的酶活力，結(jié)合肌內(nèi)脂質(zhì)脂肪酸構(gòu)成變化，明確二者與肌內(nèi)磷脂降解的相關(guān)性;進(jìn)一步通過粗酶液與卵磷脂模擬反應(yīng)體系的特征產(chǎn)物分析，確定二者中哪種酶的作用更大;最后，從鴨肉中分離純化出該酶，并研究其酶學(xué)特性。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.板鴨加工中肌內(nèi)脂質(zhì)、理化指標(biāo)和超微結(jié)構(gòu)變化
　　檢測板鴨加工過程中肌內(nèi)脂肪含量、中性酯占總脂比例、游離脂肪酸占總脂比例、磷脂占總脂比例、NaCl含量、TBA值、水分含量、pH

3、值、蛋白質(zhì)含量、游離氨基酸含量、L*、a*、b*以及超微結(jié)構(gòu)的變化情況。結(jié)果表明:在板鴨加工中，pH值、中性酯占總脂比例、b*值變化不明顯（P＞0.05），水分、肌內(nèi)磷脂占總脂比例、L*值、a*值顯著降低(P＜0.05)，而NaCl含量、脂肪含量、游離脂肪酸占總脂比例、蛋白質(zhì)含量、游離氨基酸總含量、TBA值明顯升高(P＜0.05);同時肌肉超微結(jié)構(gòu)在風(fēng)干階段發(fā)生明顯的收縮，并出現(xiàn)裂縫。相關(guān)性分析表明，磷脂占總脂比例和游離脂肪酸占總脂比例

4、呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.998，P＜0.01），而中性脂占總脂比例和游離脂肪酸占總脂比例顯著正相關(guān)(P＜0.01)，表明板鴨加工過程中磷脂發(fā)生水解產(chǎn)生了游離脂肪酸;磷脂占總脂比例與NaCl含量、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量、TBA值、水分含量、中性酯比例、游離脂肪酸比例、游離氨基酸總含量等指標(biāo)極顯著相關(guān)(P＜0.01)。綜合上述結(jié)果，初步明確了在板鴨加工中，肌內(nèi)磷脂處于高鹽、弱酸的環(huán)境，并發(fā)生了降解現(xiàn)象，同時肌肉內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞和收縮擠壓，為磷脂

5、與胞內(nèi)酶類的接觸增加了機(jī)會，也為加速磷脂降解產(chǎn)物-游離脂肪酸的氧化提供了可能。
　　2.板鴨加工中磷脂酶A2和磷脂酶C活力變化及其與肌內(nèi)磷脂降解的相關(guān)性
　　跟蹤板鴨加工過程中，腿肉中磷脂酶A2、磷脂酶C酶活力以及中性酯、游離脂肪酸、磷脂脂肪酸構(gòu)成的變化。結(jié)果表明:磷脂酶A2的活性在板鴨加工過程中逐漸下降（P＜0.05），但到風(fēng)干12天時仍能保留83.70％的酶活力;磷脂酶C的活性從原料到干腌時顯著升高(P＜0.05)，然后

6、從干腌到風(fēng)干6天顯著下降，在風(fēng)干6天到12天時顯著升高（P＜0.05），在加工末期磷脂酶C保留86.78％的酶活力;游離脂肪酸和中性脂中不飽和脂肪酸的比例逐漸升高(P＜0.05)，二者的增加量與磷脂中多不飽和脂肪酸的減少量顯著相關(guān)（r=-0.841，P＜0.05，r=-0.946，P＜0.01），對單個脂肪酸而言，磷脂中亞油酸(C18∶2)和花生四烯酸(C20∶4)顯著減少(P＜0.05)，然而在游離脂肪酸和中性酯中它們顯著升高（P＜0

7、.05）。上述結(jié)果，初步證實(shí)了板鴨加工中，磷脂酶A2和磷脂酶C參與了肌內(nèi)磷脂的水解。
　　3.磷脂模擬體系中磷脂酶A2和磷脂酶C的酶解作用比較
　　以鴨肉中客觀存在的一種卵磷脂(C18∶2/C16∶0 PC)為底物，與鴨肉粗酶液組成模擬體系，反應(yīng)條件與板鴨加工條件（溫度10℃以下）和產(chǎn)品特點(diǎn)（鹽分含量8.92％、pH6.2左右）相對應(yīng)，即反應(yīng)條件為pH6.2、溫度9℃、NaCl含量8.92％、時間為60h，通過HPLC-EL

8、SD（高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器）分析特征酶解產(chǎn)物。結(jié)果如下:建立了HPLC-ELSD卵磷脂模擬反應(yīng)體系中酶解產(chǎn)物的分析方法;首先通過二氯甲烷-甲醇（2/1，體積比）充分萃取卵磷脂模擬反應(yīng)體系中的酶解產(chǎn)物，再通過HPLC-ELSD對產(chǎn)物進(jìn)行分析;HPLC的色譜柱為XBridge C18，250 mm×4.6 mm×5.0μm，柱溫40℃;流動相A、B、C分別為二氯甲烷、乙腈、水，采用梯度洗脫;ELSD檢測器:氮?dú)忪F化，增益50，霧化

9、溫度65℃，氣流壓力45 psi;在該色譜條件下卵磷脂(PC)、溶血卵磷脂(LPC)、脂肪酸(FA)、甘油單酯(MG)、甘油二酯(DG)、甘油三酯(TG)分離良好，回歸方程的相關(guān)系數(shù)均超過0.99;通過HPLC-ELSD分析，模擬體系中卵磷脂的初始含量為1978.24μg，酶解反應(yīng)后下降到1626.35μg，酶解產(chǎn)物中檢測少量的磷脂酶A2特征性產(chǎn)物L(fēng)PC和FA（分別為49.67μg和42.25μg），但并未發(fā)現(xiàn)磷脂酶C的酶解產(chǎn)物DG。以

10、上結(jié)果證實(shí)磷脂酶A2在磷脂酶解中作用更大。
　　4.磷脂酶A2的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)
　　從鴨腿肉中提取純化磷脂酶A2后，研究其最適溫度、最適pH、熱穩(wěn)定性、動力學(xué)方程、金屬離子對酶活力的影響等酶學(xué)特性。結(jié)果表明:利用緩沖液（50 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，3 mM MgCl2，50 mM KCl，10 mM2-mercaptoethanol，pH7.5）從鴨腿肉中提取磷脂酶A2粗酶液，隨后依次采用70％硫

11、酸銨沉淀、DEAE-Cellulose(DE-52)陰離子交換層析100％線性洗脫、Superdex200凝膠過濾層析、Source15Q陰離子交換層析45 min達(dá)到100％緩沖液(50 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，3 mM MgCl2，50 mM KCl，10 mM2-mercaptoethanol，1 MNaCl，pH7.5)線性洗脫，最終獲得了基本達(dá)到電泳純的磷脂酶A2，經(jīng)SDS-PAGE測定發(fā)現(xiàn)其分子量約為50

12、 kDa，純化后磷脂酶A2的比活力達(dá)到282.1 U/mg，純度提高了201.5倍，回收率為1.5％;該酶的最適反應(yīng)溫度為32℃，最適反應(yīng)pH值為6.0，32℃以下有較好的穩(wěn)定性，而在60℃時極易失活，該酶作用底物為L-α-1-棕櫚酰屯基-2-[14C]花生四烯酸-sn-甘油磷脂酰膽堿時的Km為0.03 mmol/L，最大反應(yīng)速度Vmax為1000 U/mg; Cu2+、 Ca2+對鴨肉磷脂酶A2有激活作用，其中Cu2+的激活作用更為明

13、顯，在濃度為10mM時，鴨肉磷脂酶A2的相對酶活力增加了51.33％，而Mn2+和Zn2+對磷脂酶A2的酶活力影響不大。上述結(jié)果表明，鴨肉中存在的這種磷脂酶A2，在板鴨加工條件（低溫、高鹽）下其酶活力相對穩(wěn)定，且肌肉內(nèi)環(huán)境的pH值接近該酶的最適pH值。
　　綜上所述:板鴨加工過程中，伴隨著肌肉理化指標(biāo)和超微結(jié)構(gòu)的改變，肌內(nèi)磷脂在磷脂酶A2、磷脂酶C等作用下發(fā)生了水解;通過分析卵磷脂模擬反應(yīng)體系特征酶解產(chǎn)物和磷脂酶A2的酶學(xué)特性，共