葡萄果實(shí)中磷脂酶D基因的克隆及其在溫度鍛煉中的作用.pdf

1、本研究以霞多麗葡萄(Vitis Vinifera L.cv.Chardonnay)果實(shí)為試材，首先克隆了其磷脂酶Da基因的cDNA序列全長(zhǎng)，然后在活性、蛋白、mRNA水平研究了葡萄磷脂酶D在溫度鍛煉中的變化規(guī)律，并進(jìn)一步通過(guò)抑制劑處理分析了磷脂酶D介導(dǎo)的溫度鍛煉信號(hào)傳遞機(jī)制。主要結(jié)果如下： 根據(jù)GenBank中登陸的其他植物磷脂酶Da序列，設(shè)計(jì)合成簡(jiǎn)并引物，利用RT-PCR(reversetranscriptation-poly

2、merase chain reaction)和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技術(shù)克隆了葡萄果實(shí)磷脂酶Da的cDNA全長(zhǎng)序列，并在GenBank進(jìn)行了注冊(cè)登錄，登錄號(hào)為DQ333882。此核苷酸序列具有完整的開(kāi)放閱讀框，編碼區(qū)全長(zhǎng)2430bp。軟件分析顯示，葡萄磷脂酶Da基因編碼一個(gè)由809個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量91.8KDa，其氨基酸序列與擬南芥(Arabidopsis)、蓖麻(Rici

3、nus communis)中的磷脂酶Da分別有74％和84％的同源性。生物信息學(xué)研究顯示，該葡萄磷脂酶Da具有C2結(jié)構(gòu)域、HKD結(jié)構(gòu)域等植物磷脂酶D的典型結(jié)構(gòu)特征。以[a-<'32>P]標(biāo)記的葡萄磷脂酶Da基因的3'末端作為探針與基因組DNA進(jìn)行雜交發(fā)現(xiàn)，該基因在葡萄基因組可能存在1-2個(gè)拷貝。 采用底物放射性標(biāo)記法，對(duì)葡萄果實(shí)磷脂酶D活性測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值為6.5的Mes緩沖液系統(tǒng)中含有15mM Ca<'2+>時(shí)，磷脂酶D具

4、有最大活性。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系中蛋白含量和反應(yīng)時(shí)間，建立了葡萄果實(shí)磷脂酶D活性測(cè)定的技術(shù)體系。為探討磷脂酶D在果實(shí)采后適應(yīng)性中的作用奠定了基礎(chǔ)。 溫度鍛煉是提高植物耐熱性的有效方法，但目前對(duì)于植物如何感知、識(shí)別溫度信號(hào)進(jìn)而放大、傳遞到胞內(nèi)的作用機(jī)理仍不完全清楚。在38℃高溫鍛煉的初期，葡萄果實(shí)中磷脂酶D的活性明顯增強(qiáng)，擬南芥PLDa1抗體免疫識(shí)別的蛋白分子量為92KDa，與根據(jù)葡萄磷脂酶D氨基酸序列計(jì)算的分子量相似，其在高溫

5、鍛煉中的變化規(guī)律與磷脂酶D活性的變化一致。而RT_PCR分析的結(jié)果則表明，早在高溫鍛煉的第30min葡萄磷脂酶D mRNA就出現(xiàn)表達(dá)高峰。使用磷脂酶D的活性抑制劑正丁醇對(duì)葡萄果實(shí)進(jìn)行預(yù)處理后，則發(fā)現(xiàn)高溫鍛煉誘導(dǎo)的果實(shí)組織內(nèi)自由態(tài)SA含量的升高、HSP73蛋白的表達(dá)均被抑制。以上結(jié)果說(shuō)明，磷脂酶D活性的升高可以作為果實(shí)響應(yīng)高溫信號(hào)的前期反應(yīng)，并且磷脂酶D可能作為上游信號(hào)組分參與SA信號(hào)系統(tǒng)影響高溫鍛煉誘導(dǎo)果實(shí)耐熱性的產(chǎn)生。 8℃低