基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析副溶血性弧菌對超高壓的耐受機理.pdf

1、本文通過對水產(chǎn)品致病菌——副溶血性弧菌（VibrioParahaemolyticus）的致病株C4株系進行多輪超高壓篩選，得到相應(yīng)的耐壓菌株N11。接著以C4和N11菌株為研究對象，分析了超高壓處理對這2株細菌的細胞壁膜影響、細胞損傷情況、以及耐壓菌株的耐壓機理。進而利用Seq-RNA測序技術(shù)分析超高壓脅迫下這2株菌內(nèi)的差異表達基因，結(jié)合基因組數(shù)據(jù)篩選出的耐壓菌株N11中的突變堿基位點，采用實時熒光定量PCR技術(shù)考察了差異表達基因和突變

2、位點調(diào)控的基因在超高壓脅迫下的表達規(guī)律，從分子水平探討了副溶血性弧菌對超高壓的耐受機理。具體結(jié)論如下:
　　(1)研究了副溶血性弧菌原始菌株C4株和耐壓菌株N11株對超高壓的耐受性，在200 MPa以上(含200 MPa)壓力處理時，C4株全部死亡，N11株有少量細菌存活。
　　(2)分析超高壓處理對C4和N11菌株細胞膜通透性、Na+/K+-ATP酶活、表面zeta電位、細胞超微結(jié)構(gòu)、胞內(nèi)CAT酶活性的影響。結(jié)果表明超高壓

3、可破壞細胞壁膜的結(jié)構(gòu)，造成細胞膜通透性增加、酶活性降低、細胞內(nèi)容物泄漏、細胞擬核凝聚和低電子區(qū)等現(xiàn)象;在相同壓力的超高壓脅迫下，C4株細胞壁膜的破壞程度較耐壓菌株高，超高壓殺菌的主要原因可能是通過損傷細胞壁膜發(fā)揮作用;N11株中的過氧化氫酶對超高壓有更高的抗逆性，進而提高了菌株對超高壓的耐受性。
　　(3)采用RNA-Seq測序技術(shù)分析了C4和N11菌株在超高壓脅迫前后的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，從中篩選出一系列的差異表達基因。進而對這些差異表

4、達基因進行COG和WEGO功能分析，發(fā)現(xiàn)在壓力脅迫條件下，野生型菌株C4內(nèi)與細胞膜結(jié)合蛋白、代謝及生物調(diào)控過程等相關(guān)的基因表達水平發(fā)生明顯變化，同時，與無機鹽離子轉(zhuǎn)運與代謝、抗氧化作用、細胞殺傷作用相關(guān)基因的表達發(fā)生了下調(diào)，這可能是導(dǎo)致副溶血性弧菌的細胞膜遭到破壞，繼而誘發(fā)細菌死亡的重要原因;而耐壓菌株在壓力脅迫時，與細胞活力、轉(zhuǎn)運蛋白、生物過程調(diào)控相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平明顯發(fā)生提高、此外還有含CBS結(jié)構(gòu)域膜蛋白、ABC型磷酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、5

5、0S核糖體蛋白、周質(zhì)蛋白相關(guān)基因的表達也發(fā)生了上調(diào)，這都有助于耐壓菌株N11對超高壓脅迫的耐受能力。
　　(4)對上述差異表達基因進行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)超高壓處理后，與野生型C4株相比，耐壓菌株N11對碳源和氨基酸的利用能力有所降低，且能量合成量減少。
　　(5)對野生型C4和耐壓菌株N11之間進行全基因組的比較分析，從N11株中預(yù)測出編碼區(qū)內(nèi)有8個基因共16個核苷酸位點發(fā)生了突變，非編碼區(qū)內(nèi)有22個核苷酸位點發(fā)生了突

6、變。進而，在這些突變位點兩側(cè)設(shè)計引物，通過PCR擴增和測序，最終鑒定出18個堿基位點發(fā)生了突變，它們均位于非編碼區(qū)，推測這些突變的堿基位點可能通過影響上下游基因的表達水平，從而來增強細胞的耐受超高壓能力。
　　(6)采用實時熒光定量PCR考察突變位點上下游基因在野生型C4和耐壓菌株N11之間的表達水平，發(fā)現(xiàn)C4_4362基因在C4株中表達量顯著下調(diào)可提高其對壓力敏感性;C4_4609基因的表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)大量表達可能會導(dǎo)致菌株死亡