金屬配合物的合成及其與人血清白蛋白相互作用的抗腫瘤活性的研究.pdf

1、本文合成了兩類(lèi)金屬配合物。第一類(lèi)金屬配合物是以希夫堿縮氨基硫脲為配體的銅金屬配合物。第二類(lèi)金屬配合物是以白花丹素為配體，合成了兩個(gè)還沒(méi)有見(jiàn)報(bào)道的銅金屬配合物。我們利用元素分析、紅外光譜、質(zhì)譜以及單晶x-射線衍射分析等技術(shù)對(duì)這些金屬配合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征鑒定。在細(xì)胞水平上，利用MTT法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法和熒光拍照等手段對(duì)這些金屬配合物進(jìn)行體外抗腫瘤活性的檢測(cè)，以及其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究。在分子水平上，利用蛋白免疫印記技術(shù)(Wester

2、n Blot)檢測(cè)這些金屬配合物對(duì)凋亡相關(guān)蛋白以及周期相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響。本論文研究?jī)?nèi)容主要為以下幾點(diǎn):
　　1.簡(jiǎn)要介紹腫瘤現(xiàn)狀和抗癌藥物的一些概況;概述了希夫堿縮氨基硫脲及其金屬配合物的生物活性的研究進(jìn)展;對(duì)人血清白蛋白(HSA)作為藥物載體靶向治療腫瘤的研究做了簡(jiǎn)單的介紹，并在此基礎(chǔ)上簡(jiǎn)要的闡述了本論文的選題依據(jù)以及意義。
　　2.銅(Ⅱ)配合物被認(rèn)為是作為下一代金屬抗癌藥物的一個(gè)很有前景的候選藥物，并被廣泛研究。

3、因此，本章合成了四個(gè)由希夫堿縮氨基硫脲(L1-L4)為配體的雙核銅(Ⅱ)配合物，即[CuCl(L1)]2(C1)，[CuNO3(L2)]2(C2)，[Cu(NCS)(L3)]2(C3)和[Cu(CH3COO)(L4)]2(C4)。用x-射線晶體衍射分析解析這四種配合物的晶體結(jié)構(gòu)。通過(guò)MTT法、熒光顯微鏡觀察拍照法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法以及Western Blot研究了C1-C4配合物和C4-HSA復(fù)合物的抗腫瘤活性和作用機(jī)制。研究結(jié)果如下:

4、(1)MTT法檢測(cè)到Cu(Ⅱ)離子和配體(HL)對(duì)BEL-7404、A549、NCI-H460這幾種癌細(xì)胞的作用效果并不好，但是C1-C4配合物對(duì)癌細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒性。比較配合物C1-C4，發(fā)現(xiàn)C4配合物的細(xì)胞毒性最強(qiáng)，而C1配合物的細(xì)胞毒性最弱。C4配合物是C2和C3配合物的兩倍，而C2和C3配合物又是C1配合物毒性的兩倍。C4配合物對(duì)上述三種癌細(xì)胞的IC50依次為0.486±0.010、0.507±0.021、0.235±0.0

5、10μM，當(dāng)然，一旦它們與人血清白蛋白相互作用后，對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性會(huì)提高，相應(yīng)的IC50會(huì)降低。(2)以人肝癌細(xì)胞BEL-7404為代表，我們研究了C1-C4配合物和C4-HSA復(fù)合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制。本章利用吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)熒光染色法和FITC AnnexinⅤ/PI雙染檢測(cè)法，表明上述配合物可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。利用JC-1染色實(shí)驗(yàn)、活性氧(ROS)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、GSH/GSSG檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)C1-C4配合物以及C4-HS

6、A復(fù)合物誘導(dǎo)BEL-7404細(xì)胞凋亡機(jī)制進(jìn)行了研究。JC-1染色結(jié)果表明，上述幾種物質(zhì)刺激BEL-7404細(xì)胞后，用JC-1染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞逐漸由發(fā)紅色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)綠色熒光，表明線粒體膜電位降低，說(shuō)明癌細(xì)胞發(fā)生了凋亡。ROS和GSH/GSSG實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于空白對(duì)照組而言，這幾種物質(zhì)使得細(xì)胞內(nèi)ROS的水平提高了，GSH/GSSG的比值降低了，其中C1-C4這四種配合物中，C4配合物ROS水平最高，GSH/GSSG的比值最低，而C1配合

7、物ROS水平提高得最小、GSH/GSSG的比值最大，這可能與這四種配合物上所帶的官能團(tuán)有關(guān)。(3)采用Western Blot檢測(cè)了C1-C4配合物以及C4與HSA相互作用后對(duì)BEL-7404細(xì)胞中的Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白以及caspase-9、caspase-3蛋白表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)下調(diào)了，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致Bax/Bcl-2的比值變大了，促使腫瘤細(xì)胞更

8、容易發(fā)生凋亡。此外，細(xì)胞色素C(Cyt-c)的釋放促進(jìn)了caspase家族蛋白的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了C1-C4配合物以及C4配合物和HSA相互作用后對(duì)細(xì)胞的抗腫瘤活性的機(jī)制是通過(guò)內(nèi)源性線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。
　　3.以天然白花丹素為配體(PLN)合成了四個(gè)銅(Ⅱ)金屬配合物，它們依次為[Cu(PLN)2]·2H2O(C1);[Cu(PLN)(bipy)(H2O)]NO3·2H2O(C2);[Cu(PLN)(Phen)]NO

9、3·0.25H2O(C3);[Cu(PLN)(Phen)(Br)]CH3OH(C4)。采用元素分析、紅外光譜、質(zhì)譜以及單晶x-射線衍射分析等技術(shù)對(duì)這些銅金屬配合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征鑒定，發(fā)現(xiàn)這四種銅金屬配合物(C1、C2、C3、C4)都是單核配合物。這些銅(Ⅱ)金屬配合物結(jié)構(gòu)的確定為后續(xù)的金屬基藥物抗腫瘤生物活性和作用機(jī)制的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和保障。葉酸(FA)修飾的HSA載體(FA-HSA)有望改善抗腫瘤藥物的靶向性與藥效。為了開(kāi)發(fā)金屬抗

10、腫瘤藥物的FA-HSA載體，我們研究了FA-HSA作為由天然白花丹素為配體衍生的銅(Ⅱ)金屬配合物的載體的抗腫瘤活性和機(jī)制。熒光光譜和分子對(duì)接表明，Cu(Ⅱ)金屬配合物結(jié)合到HSA的ⅡA亞結(jié)構(gòu)域上。利用MTT法研究了這四個(gè)銅金屬配合物在有無(wú)FA-HSA載體的條件下對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)這兩種腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明，與單獨(dú)的銅(Ⅱ)金屬配合物作用于腫瘤細(xì)胞相比，在某種程度上，通過(guò)選擇性的在

11、腫瘤細(xì)胞中積累葉酸-人血清白蛋白-金屬藥物復(fù)合物，從而增強(qiáng)該復(fù)合物對(duì)葉酸陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，但是沒(méi)有提高對(duì)在體外的正常細(xì)胞(WI-38)的細(xì)胞毒性;利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)法，檢測(cè)裸藥C3和該裸藥與載體的復(fù)合物，即葉酸-人血清白蛋白-金屬藥物復(fù)合物對(duì)HeLa周期的影響，結(jié)果顯示，葉酸-人血清白蛋白-金屬藥物復(fù)合物對(duì)HeLa的G2/M期的細(xì)胞周期阻滯能力更強(qiáng)，并下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1(CDK1)和細(xì)胞周期蛋白B1的表達(dá)水平。此外，葉