蓮藕褐變相關(guān)酶酶學(xué)特性及豌豆發(fā)酵液對其抑制作用.pdf

1、采用硫酸銨沉淀結(jié)合DEAE-52及SephadexG-75柱層析等純化步驟實(shí)現(xiàn)了蓮藕中多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)，過氧化物酶(peroxidase，POD)，的分離純化，并通過SDS-PAGE，凝膠過濾層析方法進(jìn)行了純度鑒定和分子量測定;采用雙水相萃取法，在蓮藕中初步純化了苯丙氨酸解氨酶(phenylalnineammonialyase，PAL)。研究了蓮藕中PPO、POD、PAL的酶學(xué)性質(zhì)，不同化合物，金

2、屬離子對其酶學(xué)特性的影響，重點(diǎn)研究了乳酸菌豌豆發(fā)酵液中防褐變成份對蓮藕PPO、POD的抑制作用以及對酶學(xué)特性影響，并采用圓二色譜(CD)，傅立葉紅外光譜(FTIR)研究了其作用后對酶結(jié)構(gòu)的改變。其主要研究結(jié)果如下:
　　 1.蓮藕中PPO，POD，PAL的分離純化及其基本性質(zhì)
　　 蓮藕中的PPO，POD，分別純化了55.71，30.68倍，蛋白質(zhì)回收率為1.85％，分子量均為58.3kDa。采用雙水相法分離純化蓮藕中的

3、PAL，PAL的純化倍數(shù)為4.1，回收率達(dá)到82.7％。蓮藕PPO對不同酚類的親和力，其中多元酚＞二元酚＞一元酚，最適底物為焦性沒食子酸;蓮藕POD對愈創(chuàng)木酚的親和性大于過氧化氫。PAL的最適反應(yīng)條件是:溫度為60℃，pH值為8.8時(shí)，酶活性表現(xiàn)最高，以L-苯丙氨酸為底物的最適底物濃度為40mM。
　　 2.不同化合物對蓮藕PPO、POD活性影響
　　 苯甲酸，EDTA-2Na，山梨酸鉀對PPO活性無明顯抑制作用;AA，

4、檸檬酸，L-半胱氨酸，亞硫酸鈉，PHBA，TL對PPO活性抑制作用明顯。PHBA高濃度時(shí)，對PPO抑制作用明顯，而低濃度時(shí)，對PPO活性有促進(jìn)作用。對POD的抑制作用，AA最為顯著;檸檬酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、PHBA的作用不明顯。高濃度PHBA對POD無抑制作用，在低濃度時(shí)，對POD有一定的抑制作用;TL濃度的增大，對POD的抑制作用越強(qiáng)。
　　 3.不同金屬離子對蓮藕PPO，POD活性影響
　　 Al3+，F(xiàn)e2

5、+，Cu2+，Ca2+，Mg2+，F(xiàn)e3+，Hg2+，Mn2+對蓮藕中PPO活性都有促進(jìn)作用。但是Mn2+對POD具有較強(qiáng)的抑制作用，Mg2+對其抑制作用較弱;Hg2+在高濃度時(shí)能夠強(qiáng)烈抑制蓮藕POD活性，低濃度時(shí)抑制作用不明顯。
　　 4.亞硫酸鈉，AA，TL，PHBA對蓮藕PPO、POD酶學(xué)特性影響
　　 亞硫酸鈉抑制PPO作用屬于可逆過程，競爭型抑制;抑制常數(shù)KI為1.71。AA對蓮藕PPO、POD的作用類型都是屬

6、于可逆過程，競爭型抑制。對PPO的抑制常數(shù)KI為6.17，對POD抑制常數(shù)KI為1.64。TL對蓮藕PPO的作用類型是可逆過程的競爭型抑制，對蓮藕PPO的抑制常數(shù)KI為1.5。TL對蓮藕POD的作用類型是可逆過程的反競爭型抑制，對蓮藕POD抑制常數(shù)(KIS)為1.03。PHBA對蓮藕中PPO的作用類型是可逆過程中的競爭型抑制，對蓮藕PPO的抑制常數(shù)KI為0.52。PHBA對蓮藕中的POD作用屬于可逆過程，在PHBA濃度為0.2-0.6m

7、M區(qū)間，其抑制作用機(jī)理表現(xiàn)為反競爭性抑制類型，對蓮藕POD的抑制常數(shù)(KIS)為0.17。
　　 5.蓮藕PPO、POD的CD、FTIR光譜分析
　　 蓮藕中PPO、POD通過圓二色譜分析，在190nm附近有一正吸收峰，在206nm和223nm處有兩顯著的負(fù)吸收峰，表明其α-螺旋含量很高，β-折疊較低，進(jìn)一步通過傅立葉紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，在酰胺Ⅰ帶具有強(qiáng)吸收峰，且在1650cm-1附近吸收最強(qiáng)，表明樣品含有大量的α-螺旋和

8、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，在1261cm-1附近也出現(xiàn)吸收峰，進(jìn)一步證明樣品中含有無規(guī)則卷曲，結(jié)果顯示蓮藕PPO、POD主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，其含量分別是:50.60％的α-螺旋，3.90％的β-折疊，45.50％的無規(guī)則卷曲。
　　 6.亞硫酸鈉，抗壞血酸，TL，PHBA作用于蓮藕PPO、POD后其結(jié)構(gòu)的改變
　　 亞硫酸鈉對蓮藕PPO活性有顯著的抑制作用，其作用于蓮藕PPO、POD后，樣品中的α-螺旋含量迅速變小但沒

9、消失，β-折疊含量迅速上升，出現(xiàn)少量的β-轉(zhuǎn)角，無規(guī)則卷曲變化不大;同樣AA處理后，樣品中的α-螺旋含量逐漸下降，β-折疊含量先緩慢上升后下降至消失，無規(guī)則卷曲含量逐步上升，說明AA濃度越大，對蓮藕PPO、POD的作用越強(qiáng)烈，在高濃度時(shí)出現(xiàn)了一定量的β-轉(zhuǎn)角;TL作用下，蓮藕PPO、POD中α-螺旋含量迅速變小但沒消失，β-折疊含量迅速上升，無規(guī)則卷曲變化不大，β-轉(zhuǎn)角含量小幅度上升;THBA作用于蓮藕PPO，POD，樣品中α-螺旋含量