SIRT1在間充質(zhì)干細(xì)胞衰老中的作用及其機(jī)制研究CX32-CX43在肝干-祖細(xì)胞分化中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、早在上世紀(jì)六十年代,美國(guó)學(xué)者Leonard Hayflick發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中其分裂的次數(shù)是有限的,并且細(xì)胞在體外可傳代的次數(shù)與其壽命有關(guān),并由此提出“Hayflick界限”理論。對(duì)多細(xì)胞有機(jī)體來(lái)說(shuō),衰老是組織內(nèi)的穩(wěn)態(tài)以及器官功能逐步喪失的過(guò)程,成體干細(xì)胞廣泛的分布在身體各處,為機(jī)體的自我更新和組織修復(fù)提供細(xì)胞來(lái)源,因此人體內(nèi)自我更新的干細(xì)胞有限的分裂能力可能是引發(fā)整個(gè)機(jī)體衰老的重要原因。近些年,間充質(zhì)干細(xì)胞(Me

2、senchymal stem cells,MSCs)作為一種重要的成體干細(xì)胞受到了越來(lái)越多的關(guān)注。由于其取材方便、易于分離培養(yǎng),低免疫原性,具有多向分化潛能等諸多的優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為了在細(xì)胞治療和基因治療等領(lǐng)域較為理想的種子細(xì)胞。然而,由于MSCs在體內(nèi)所占比例較低,在臨床應(yīng)用之前需要進(jìn)行大規(guī)模的擴(kuò)增培養(yǎng)以此來(lái)獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞。但是,MSCs在體外經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)容易衰老,其形態(tài)和生理機(jī)能會(huì)發(fā)生較大改變。例如:增殖減慢,生長(zhǎng)停滯;干性減退,喪

3、失分化能力;甚至具有致瘤性,這些經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的MSCs已經(jīng)不再適用于臨床應(yīng)用。因此研究MSCs的衰老不僅僅可以使我們多角度的來(lái)認(rèn)識(shí)機(jī)體發(fā)生衰老的機(jī)制,同時(shí)還可以為以后的臨床治療提供更優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞來(lái)源。
　　基于這種目的,我們?cè)O(shè)計(jì)了這個(gè)課題,希望在探索MSCs衰老分子機(jī)制的同時(shí)能夠找出一種可以延長(zhǎng)MSCs壽命的新方法。近些年來(lái),很多研究團(tuán)隊(duì)都關(guān)注到了沉默信息調(diào)節(jié)蛋白2(silent information regulator 2,S

4、IR2)在調(diào)節(jié)低等生物抵抗不良環(huán)境以及延長(zhǎng)其生存周期等過(guò)程中所發(fā)揮的重要作用。同樣,在哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在的蛋白去乙?；窼IRT1與SIR2高度同源,越來(lái)越多的研究也表明SIRT1可以通過(guò)調(diào)控P53,Ku70,FOXO,E2F1,NF-κB,和PGC-1α等關(guān)鍵分子的表達(dá),進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞的衰老、凋亡、代謝等生理活動(dòng)。為了研究SIRT1在MSCs衰老中的作用,我們通過(guò)慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體系將SIRT1的干涉表達(dá)和過(guò)表達(dá)載體分別導(dǎo)入到MSCs中

5、,同時(shí)結(jié)合細(xì)胞增殖和衰老等相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè),來(lái)研究SIRT1對(duì)MSCs增殖和衰老的影響。
　　首先在研究當(dāng)中,我們觀察到骨髓和脂肪來(lái)源的MSCs在體外經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)之后,出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯、細(xì)胞形態(tài)變大扁平等衰老特征,衰老相關(guān)半乳糖苷酶染色(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)表明隨著細(xì)胞不斷的傳代,衰老細(xì)胞的比例逐漸增多,SIRT1蛋白水平的表達(dá)會(huì)隨著細(xì)胞不斷的傳代而顯著的下降。

6、雖然不同組織來(lái)源、不同個(gè)體來(lái)源的SIRT1的下調(diào)水平略有不同,但是整體趨勢(shì)是一致的。這就提示我們,SIRT1在MSCs衰老的進(jìn)程當(dāng)中可能會(huì)發(fā)揮著重要的作用。
　　因此,我們先通過(guò)抑制SIRT1的表達(dá)來(lái)研究SIRT1與衰老發(fā)生之間的關(guān)系。在研究當(dāng)中,我們利用慢病毒轉(zhuǎn)染體系結(jié)合RNA干涉技術(shù),在早期骨髓和脂肪來(lái)源的MSCs中成功地下調(diào)SIRT1的表達(dá)(干涉效率﹥90％)。為排除ShRNA潛在的脫靶效應(yīng),我們選擇了兩套針對(duì)SIRT1序列

7、不同位點(diǎn)的ShRNA。通過(guò)BrdU摻入實(shí)驗(yàn)和PI染色實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn),在下調(diào)表達(dá)SIRT1的骨髓和脂肪來(lái)源的MSCs中,處于增殖期的細(xì)胞數(shù)目分別為對(duì)照組的32%和45%,生長(zhǎng)曲線也表明細(xì)胞增殖顯著減慢。通過(guò)SA-β-gal衰老特異染色我們發(fā)現(xiàn),在長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)過(guò)程中,SIRT1的下調(diào)表達(dá)會(huì)明顯的促進(jìn)細(xì)胞的衰老,衰老細(xì)胞的數(shù)目在兩種不同類型的MSCs中分別增加5.5倍和4.7倍。上述結(jié)果表明抑制SIRT1的表達(dá)會(huì)降低MSCs的增殖,加速細(xì)胞的衰

8、老,SIRT1在維持MSCs未衰老狀態(tài)中發(fā)揮著不可或缺的作用。
　　接下來(lái)我們從反面驗(yàn)證,SIRT1的過(guò)表達(dá)是不是可以促進(jìn)MSCs的增殖或者延緩MSCs的衰老甚至是逆轉(zhuǎn)衰老的細(xì)胞。同樣,我們利用慢病毒轉(zhuǎn)染體系,在骨髓來(lái)源的MSCs當(dāng)中成功過(guò)表達(dá)SIRT1以及無(wú)酶活性的負(fù)顯性突變體SIRT1-H363Y,我們發(fā)現(xiàn)突變載體H363Y的作用與下調(diào)SIRT1表達(dá)的效果類似。在轉(zhuǎn)染早期,細(xì)胞增殖減慢,處于增殖期細(xì)胞數(shù)目減少5.9倍,衰老細(xì)胞

9、數(shù)目增加4.9倍。而在此時(shí),是否過(guò)表達(dá)SIRT1對(duì)細(xì)胞的增殖與衰老影響不大,然而隨著轉(zhuǎn)染細(xì)胞不斷的傳代,過(guò)表達(dá)SIRT1的MSCs與對(duì)照組相比,處于增殖期的細(xì)胞數(shù)目是對(duì)照組的2.7倍,衰老的細(xì)胞數(shù)目卻只有對(duì)照組的56%,細(xì)胞增殖期延長(zhǎng)30天左右才會(huì)進(jìn)入到平臺(tái)期。但是,SIRT1過(guò)表達(dá)的MSCs最終還是會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯的現(xiàn)象,進(jìn)入衰老期。因此,我們可以得出結(jié)論,通過(guò)體外過(guò)表達(dá)SIRT1可以延緩細(xì)胞的衰老,但是不能終止衰老的進(jìn)程。
　　

10、雖然,在MSCs中過(guò)表達(dá)SIRT1可以延緩細(xì)胞衰老,但是對(duì)于以后可能的臨床應(yīng)用,我們還要保證SIRT1過(guò)表達(dá)修飾過(guò)的MSCs仍然具有干細(xì)胞的分化潛能。我們通過(guò)流式檢測(cè)了MSCs相關(guān)的表面標(biāo)志如CD31、CD34、CD90和CD105的表達(dá),以及其成脂與成骨的分化潛能。結(jié)果表明:SIRT1過(guò)表達(dá)不會(huì)導(dǎo)致MSCs的分化,基因修飾之后的MSCs仍然具有分化潛能,這也從另外一個(gè)角度說(shuō)明了SIRT1對(duì)MSCs增殖的影響與其分化能力的改變無(wú)關(guān)。

11、r>　　為了進(jìn)一步探索SIRT1調(diào)控MSCs衰老的機(jī)制,我們著重檢測(cè)了衰老相關(guān)信號(hào)通路當(dāng)中的兩個(gè)關(guān)鍵分子P21Cip1與P16INK4a的表達(dá)變化情況。我們發(fā)現(xiàn):SIRT1下調(diào)之后引起骨髓來(lái)源MSCs的衰老,P16INK4a的表達(dá)明顯升高,P21Cip1的變化并不顯著;對(duì)于脂肪來(lái)源的MSCs來(lái)說(shuō),P21Cip1與P16INK4a的表達(dá)卻均有升高。在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的過(guò)程中,SIRT1的過(guò)表達(dá)可以減緩P16INK4a的積累,但對(duì)P21Cip1表

12、達(dá)的影響不大。這些結(jié)果表明,SIRT1影響骨髓來(lái)源的MSCs的衰老主要是通過(guò)P16INK4a信號(hào)通路并不是P21Cip1通路,同時(shí)可以看出衰老發(fā)生的機(jī)制在不同組織來(lái)源的MSCs當(dāng)中略有不同。
　　上述結(jié)果可以明確證實(shí)SIRT1可以通過(guò)調(diào)控P16INK4a的表達(dá)來(lái)影響MSCs的增殖與衰老。為了更好的應(yīng)用于臨床,我們考慮是否能夠?qū)⒁约せ頢IRT1為靶點(diǎn)的小分子作為激動(dòng)劑加入到MSCs的培養(yǎng)體系當(dāng)中。從葡萄皮當(dāng)中提取的天然化合物白藜蘆醇

13、,被很多人當(dāng)作SIRT1的天然激活劑,但是它的作用卻很有爭(zhēng)議。因此,我們?cè)谡n題當(dāng)中檢測(cè)不同濃度的白藜蘆醇以及不同的作用時(shí)間能否促進(jìn)MSCs增殖和延緩細(xì)胞衰老。我們發(fā)現(xiàn)5μM和20μM的白藜蘆醇作用兩天,可以促進(jìn)MSCs增殖,但是上述濃度的白藜蘆醇持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間作用反而加速了MSCs的死亡,這表明高濃度的白藜蘆醇具有毒性。由此可見(jiàn),白藜蘆醇只能瞬時(shí)的促進(jìn)MSCs的增殖。
　　綜上所述,我們的課題研究不僅可以使我們很好地理解SIRT1在M

14、SCs衰老過(guò)程中的作用,還有利于進(jìn)一步分析SIRT1在MSCs衰老過(guò)程中的機(jī)制,同時(shí)還提供了一個(gè)可以延緩間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的新策略。
　　藥物、酒精等因素引起的終末期肝病是困擾人類健康的一類頑疾。目前,肝細(xì)胞移植、生物人工肝以及組織工程化肝臟等治療方法的研究為終末期肝病的治療帶來(lái)新的希望。但令人遺憾的是,肝細(xì)胞來(lái)源受限、數(shù)量不足以及功能欠缺等因素制約了其進(jìn)一步應(yīng)用。胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ESCs)具有

15、分化的全能性以及高度自我更新能力,成為較為理想的種子細(xì)胞。各國(guó)科研人員通過(guò)模擬肝臟在體內(nèi)的發(fā)育環(huán)境采用分步誘導(dǎo)的方式,使ESCs依次經(jīng)定型內(nèi)胚層階段、肝干細(xì)胞階段、肝祖細(xì)胞階段、最終分化為肝細(xì)胞。通過(guò)近幾年不斷的優(yōu)化誘導(dǎo)條件,人們可以將胚胎干細(xì)胞向定型內(nèi)胚層(流式檢測(cè)CXCR4+和SOX17+雙陽(yáng)性)的效率提高到90%以上,進(jìn)一步誘導(dǎo)為肝干/祖細(xì)胞階段,其標(biāo)志性蛋白AFP的陽(yáng)性率也在93%,即使最終肝細(xì)胞特異標(biāo)志蛋白ALB和α1-AT的

16、陽(yáng)性率也在90%以上,但是成熟肝細(xì)胞的標(biāo)志ASGPR最高也只在60%左右,同時(shí)所獲得肝細(xì)胞在生物功能上與正常肝細(xì)胞仍有很大的差別。而獲得成熟有功能的肝細(xì)胞無(wú)論對(duì)終末期肝病的治療還是對(duì)藥物篩選平臺(tái)的建立都有重要意義。因此,我們將重點(diǎn)關(guān)注胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過(guò)程中肝干/祖細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化這一階段,此階段是得到有功能的成熟肝細(xì)胞的關(guān)鍵。
　　肝臟是一個(gè)復(fù)雜的異質(zhì)性器官,其中肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞有序穩(wěn)定的排列,保證了細(xì)胞與細(xì)胞之間相

17、互通訊,繼而保障肝臟發(fā)揮正常的功能。不同類型的細(xì)胞連接決定了細(xì)胞與細(xì)胞之間有序的排列。因此我們考慮是否能夠通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞之間的連接來(lái)促進(jìn)細(xì)胞之間的有序排列從而促進(jìn)肝前體細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育,最終得到功能穩(wěn)定的成熟的肝細(xì)胞。肝組織內(nèi)各細(xì)胞之間存在大量的緊密連接、縫隙連接、橋粒及半橋粒等不同類型的連接。其中縫隙連接不僅是細(xì)胞與細(xì)胞之間物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐ǖ?還可以和很多蛋白偶聯(lián),受它們的調(diào)控或借助它們調(diào)控下游的分子從而發(fā)揮更大的功能?？p隙連接蛋白Conne

18、xin32和Connexin43(CX32/CX43)是肝臟中最重要的兩類縫隙連接蛋白。我們發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)在肝干細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)變過(guò)程中出現(xiàn)同步 相反的變化,即在肝祖細(xì)胞階段CX32低表達(dá)而CX43高表達(dá),隨著向肝細(xì)胞的分化CX43表達(dá)降低CX32表達(dá)則會(huì)升高。這一現(xiàn)象提示二者表達(dá)變化可能在肝干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化及成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用,同時(shí)CX32/CX43的這種同步上調(diào)與下調(diào)表達(dá)又有可能受到什么關(guān)鍵分子的調(diào)控?在本部分實(shí)驗(yàn)中,我們開(kāi)展了

19、縫隙連結(jié)蛋白CX32/CX43在肝干/祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化中的作用及其機(jī)制研究。希望從細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用的角度來(lái)尋找肝細(xì)胞分化成熟的新機(jī)制,同時(shí)探索其中可能的分子機(jī)制,最終目的在于引入新策略進(jìn)一步優(yōu)化胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化體系。
　　我們使用目前較為公認(rèn)的肝干/祖細(xì)胞系(WB-F344)作為研究對(duì)象,該細(xì)胞系易于在體外培養(yǎng)和進(jìn)行基因操作,且具備向膽管上皮細(xì)胞以及肝細(xì)胞的雙向分化潛能,其所處的發(fā)育階段與我們要重點(diǎn)關(guān)注的胚胎干

20、細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的過(guò)程中的肝祖細(xì)胞階段類似。我們對(duì) WB-F344 進(jìn)行雙向的誘導(dǎo)分化,通過(guò) Realtime PCR 和Western blot、免疫熒光檢測(cè)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)WB-F344向肝細(xì)胞分化中存在CX43表達(dá)下調(diào)、CX32上調(diào)的規(guī)律,而向膽管分化過(guò)程中則呈現(xiàn)出相反的變化,這與CX43和CX32在體內(nèi)的分布具有一致性,即CX32僅高表達(dá)在肝細(xì)胞膜表面,CX43在膽管附近有干性的細(xì)胞中高表達(dá)。
　　為了能夠更

21、好的研究CX43和CX32表達(dá)變化與肝向分化之間的關(guān)系,我們構(gòu)建了CX32和CX43慢病毒表達(dá)載體和CX43干涉表達(dá)載體,并分別建立起穩(wěn)定轉(zhuǎn)染上述載體的WB細(xì)胞系。將其放在向肝細(xì)胞分化的條件下誘導(dǎo),結(jié)果表明:CX32過(guò)表達(dá)以及CX43下調(diào)表達(dá)對(duì)于肝干/祖細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化都有很好的促進(jìn)作用。接下來(lái),我們考慮既然CX32/CX43在肝干/祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化成熟的過(guò)程中所表現(xiàn)出來(lái)這種同步逆向的表達(dá)變化會(huì)顯著促進(jìn)肝細(xì)胞的分化，那么有沒(méi)有可能C

22、X32/CX43共同接受同一關(guān)鍵分子的調(diào)控，才使得它們上調(diào)與下調(diào)表達(dá)同步進(jìn)行？我們發(fā)現(xiàn)p38MAPK在肝干/祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化成熟的過(guò)程中是一個(gè)去磷酸化的過(guò)程，同時(shí)在大鼠的肝臟當(dāng)中，我們發(fā)現(xiàn)磷酸化的p38MAPK更多的表達(dá)在匯管區(qū)，也就是肝前體細(xì)胞富集的區(qū)域，提示抑制p38MAPK磷酸化水平有利于肝干/祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化。我們通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)，p38MAPK的小分子抑制劑可以調(diào)控CX43和CX32的表達(dá)。我們將p38MAPK的小分子抑制

23、劑加入到肝干/祖細(xì)胞向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系當(dāng)中，p38MAPK的小分子抑制劑可以明顯的抑制CX43的表達(dá)，促進(jìn)CX32的表達(dá)，從而促進(jìn)肝干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化。然而CX43的過(guò)表達(dá)會(huì)減弱p38MAPK的小分子抑制劑的作用。除此之外，我們還利用體外分離純化的原代大鼠的肝干細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證了p38MAPK的小分子抑制劑對(duì)CX32/CX43的表達(dá)調(diào)控作用，也得到了較一致的結(jié)論。
　　在前面的工作當(dāng)中，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以很好的證實(shí)無(wú)論是在WB

24、-F344細(xì)胞系還是在體外分離的大鼠原代肝干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過(guò)程中，p38MAPK均可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞連接蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝干/祖細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化。因此，我們將p38MAPK的抑制劑用于人胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過(guò)程中肝干/祖細(xì)胞階段向成熟肝細(xì)胞的階段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明p38MAPK的抑制劑對(duì)CX43的抑制作用更為明顯，也能夠更好的促進(jìn)CYP1B1的表達(dá)。
　　綜上所述：p38MAPK的小分子抑制劑可以抑制p38MAPK的磷酸