間充質(zhì)干細(xì)胞在肝纖維化形成中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝臟對慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng),以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在肝內(nèi)過多沉積為特征。肝纖維化為一動態(tài)過程,屬可逆性病變,因此,阻斷、抑制或逆轉(zhuǎn)肝纖維化是治療慢性肝病的一個重要目標(biāo)。既往認(rèn)為,肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)激活并向肌成纖維樣細(xì)胞(myofibrobla

2、sts,MFs)轉(zhuǎn)化,抑制HSC激活、增殖與遷移、誘導(dǎo)凋亡是肝纖維化治療的重要策略。近年來研究發(fā)現(xiàn),在體內(nèi)環(huán)境中通過單純抑制HSCs來治療肝纖維化的效果并不理想。而更多的研究者也逐漸認(rèn)識到HSC也不是唯一重要的影響肝纖維化形成的細(xì)胞。那么探索其他參與肝纖維化形成的細(xì)胞亞群,并深入研究其作用機(jī)制想法就越來越受到研究者的重視。
　　 肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展始終伴隨著慢性炎癥反應(yīng)。其過程中受損的肝臟會分泌大量的細(xì)胞因子,生長因子,趨化因

3、子參與纖維化的形成。與此同時多種肝外細(xì)胞群也會向受損部位趨化,發(fā)揮其作用。已有研究顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells,MSCs)也是這些肝外細(xì)胞種群之一,在肝臟損傷的過程中它們會趨化到受損部位參與了肝纖維化的形成。MSCs是一種多潛能分化的非造血干細(xì)胞,主要存在于骨髓中。以往對MSCs的了解主要集中在它有向損傷部位趨化并修復(fù)損傷的功能,因此將其作為基因治療藥物進(jìn)行開發(fā),并在某些疾病,如結(jié)締組織類疾病以及骨損

4、傷的治療中取得了良好的效果。但隨著研究的深入,研究者又發(fā)現(xiàn)MSCs在某些疾病的發(fā)生、發(fā)展中還可能發(fā)揮了某些不利的作用,如它可以促進(jìn)多種腫瘤的生長。對很多疾病特別是慢性疾病來說MSCs可能是一把雙刃劍。這些結(jié)果提示研究者應(yīng)該重新嚴(yán)格的審視MSCs在疾病當(dāng)中起到的作用。對于肝臟損傷來說,MSCs在纖維化形成中的作用目前也存在著較大的爭議。MSCs到底是促進(jìn)還是抑制纖維化的發(fā)展是我們研究的目的之一。
　　 肝纖維化形成的一個重要的特點

5、是肝脈管系統(tǒng)被大肆重建。血管系統(tǒng)重建伴隨著肝纖維化發(fā)展的始終。在此過程中肝臟必然分泌大量的與血管生成有關(guān)的細(xì)胞因子,如VEGF,IL-6,IL-8等。而某些研究者也證實在體外實驗中VEGF,PDGF等某些細(xì)胞因子或生長因子可以促進(jìn)MSCs的增殖。MSCs向受損部位趨化是一個持續(xù)的過程,只要病因存在,炎癥環(huán)境充分的建立起來,MSCs就會源源不斷向受損部位募集。為了滿足大量的、持續(xù)不斷的細(xì)胞需要,就必然有某種因為或機(jī)制促使骨髓中的MSCs自

6、我增殖補充。在此基礎(chǔ)上我們提出假設(shè),肝纖維化形成過程中分泌的大量的促血管生成的細(xì)胞因子如VEGF可能就是體內(nèi)骨髓MSCs不斷增殖的重要因為之一。
　　 當(dāng)然,體內(nèi)MSCs的趨化動員,不單單需要骨髓中MSCs的不斷增殖,還需要有某些機(jī)制調(diào)節(jié)BM-MSCs轉(zhuǎn)移出骨髓,進(jìn)而隨著外周血趨化募集到受損的部位。目前研究顯示MSCs的遷移與趨化因子家族成員及其受體密切相關(guān),其中最為重要的是CC-趨化家族和CXC-趨化家族的成員。但也有研究證明

7、不同器官或組織損傷時,影響MSCs的遷移的趨化因子及其受體是不盡相同的,因此明確何種趨化因子在肝臟損傷,肝纖維化形成過程中影響B(tài)M-MSCs向肝臟的趨化募集,就可以為控制纖維化的發(fā)展尋找新的治療靶點。
　　 本課題在建立多種小鼠動物模型的基礎(chǔ)上,使用了熒光染色,免疫組化,PCR等多種分子生物學(xué)技術(shù),探討MSCs在肝纖維化形成過程中發(fā)揮的作用及其對肝功能的影響。并同時深入的探討了BM-MSCs在體內(nèi)增殖、遷移的主要因為及其作用機(jī)制

8、。同時結(jié)合肝硬化臨床標(biāo)本的檢測,以期進(jìn)一步深入了解肝纖維化的發(fā)病機(jī)制,為肝纖維化的治療提供新的思路。
　　 [實驗方法]
　　 一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 1.分別使用雄性WT-BALB/c小鼠和EGFP-BALB/c小鼠分離培養(yǎng)WT-MSCs和EGFP-MSCs細(xì)胞。采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法來分離MSCs,但此時也混有少量的單核或局勢細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞。利用這些細(xì)胞與MSCs對塑

9、料培養(yǎng)瓶的貼壁性強弱不同,細(xì)胞傳代時用0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA靜止消化2-3min后,反復(fù)多次的消化傳代后可逐漸剔除其它種類細(xì)胞。
　　 2.MSCs的鑒定
　　 倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察小鼠WT-MSCs原代培養(yǎng)的生長過程；熒光顯微鏡下觀察小鼠EGFP-MSCs細(xì)胞的生長過程。流式細(xì)胞儀技術(shù)、以及細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)檢測小鼠MSCs上表面標(biāo)記物CD34,CD90,CD45,CD90,CD105的表達(dá)情況。成

10、骨誘導(dǎo)分化Von Kossa染色,以及ALP活性定量,檢測MSCs成骨定向分化的能力,成脂誘導(dǎo)分化Oil Red O染色檢測MSCs成脂定向分化的能力。
　　 二、間充質(zhì)干細(xì)胞在肝纖維化形成中的作用
　　 構(gòu)建小鼠CCL4肝損傷模型(模型1),以及小鼠骨髓移植模型+CCL4肝損傷模型(模型2)。確定骨髓移植模型構(gòu)建成功后受體、wt小鼠骨髓內(nèi)有供體小鼠的EGFP-MSCs存在。通過尾靜脈注射外源性的EGFP-MSCs給模型

11、1的小鼠,3d后,冰凍切片免疫熒光顯微鏡下觀察外源性的MSCs的趨化部位,以及肝纖維化的程度；通過模型2示蹤內(nèi)源性的EGFP-MSCs在肝臟損傷后的趨化部位；同時檢測不同時間點AST,ALT的含量,檢測肝纖維化形成過程中肝功能的情況。
　　 三、纖維化形成過程中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的動員
　　 使用模型1和模型2的小鼠,每周末處死部分小鼠,連續(xù)5周。模型1的每周處死的小鼠,于處死前3天注射外源性的EGFP-MSCs進(jìn)行示蹤。

12、冰凍切片后熒光顯微鏡下觀察,確定內(nèi)、外源性的MSCs在小鼠動物模型中向肝臟趨化募集的時間。Realtime-PCR法篩選MSCs表面重要的趨化因子受體,以及對應(yīng)的損傷肝臟中主要的發(fā)揮作用的趨化因子。然后觀察此趨化因子在小鼠肝臟以及骨髓中的表達(dá)情況,以及體內(nèi)外試驗中對BM-MSCs的趨化能力。
　　 四、肝纖維化形成過程中VEGF促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的機(jī)制研究
　　 用免疫組化,realtime-PCR,ELISA等方

13、法檢測小鼠肝臟,血清中VEGF mRNA和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。體外細(xì)胞增殖試驗和單克隆形成試驗檢測VEGF對MSCs的增殖的影響,流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測小鼠體內(nèi)VEGF對BM-MSCs增殖的影響,以及使用Avastin是否可以逆轉(zhuǎn)這種影響。同時運用Transwell實驗及劃痕試驗檢測VEGF是否具有促進(jìn)MSCs趨化遷移的能力。
　　 五、統(tǒng)計學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS11.0以及Prism GraphPad5統(tǒng)計軟件包

14、進(jìn)行分析、作圖。P<0.05為具有顯著性差異,P<0.01為具有非常顯著性差異。
　　 [實驗結(jié)果]
　　 一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 1.MSCs的分離培養(yǎng):小鼠BM-MSCs原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后,24h后出現(xiàn)較多貼壁細(xì)胞,48-72h后成紡錘絲形或梭形生長,第4-5天開始形成典型的均勻分布的簇狀增生灶,7-10天非貼壁細(xì)胞經(jīng)反復(fù)換液而消失,細(xì)胞80％以上融合。再經(jīng)過多次傳代培養(yǎng),細(xì)胞都呈梭形。

15、人MSCs細(xì)胞系的培養(yǎng)從形態(tài)學(xué)上觀察細(xì)胞呈典型的長梭形,細(xì)胞形態(tài)趨于一致,緊密排列類似旋渦狀。
　　 2.小鼠BM-MSCs表面抗原的鑒定:運用流式細(xì)胞儀技術(shù)記憶細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù),檢測上述分離培養(yǎng)的MSCs的表面標(biāo)記物的表達(dá)情況,結(jié)果顯示其表面表達(dá)粘附分子CD29,CD105,CD90的陽性率在95％以上,而造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD34,CD45幾乎不表達(dá)。表明這些分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有MSCs特征的比例非常高。
　　

16、3.小鼠MSCs的多向分化潛能:成骨誘導(dǎo)分化后14d,我們對細(xì)胞進(jìn)行ALP陽性的檢測,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,誘導(dǎo)組ALP活性定量增高。第21d,Von Kossa染色,細(xì)胞表現(xiàn)為黑色的致密結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)分化后8d,光鏡下可見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,胞內(nèi)不乏圓形透亮脂質(zhì)空泡,應(yīng)用Oil Red-O原位染色檢測脂質(zhì)沉積,染色后可見紅色深染的脂滴
　　 二、間充質(zhì)干細(xì)胞在肝纖維化形成中的作用
　　 1.MSCs參與肝纖維化的形成:野生型

17、小鼠尾靜脈注射外源性的EGFP-MSCs隨血液循環(huán)來到受損的肝臟,冰凍切片免疫熒光圖顯示有大量的綠色熒光蛋白分布于纖維間隔的附近。內(nèi)源性的EGFP-MSCs在肝臟損傷后也趨化到受損傷的部位參與肝纖維化的形成。以SSEA4為人MSCs的標(biāo)記物,檢測MSCs在人肝纖維化組織中的表達(dá),結(jié)果顯示其主要表達(dá)的部位在纖維間隔與肝實質(zhì)區(qū)的交界處,以此標(biāo)記物流式細(xì)胞儀分離而得到的細(xì)胞,其中大部分的細(xì)胞仍然有成骨、成脂肪分化的能力,為MSCs細(xì)胞。這說明

18、MSCs細(xì)胞也同樣參與人肝纖維化的形成。
　　 2.小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)纖維化的形成
　　 天狼猩紅染色,及Masson染色觀察,以及羥脯氨酸定量檢測發(fā)現(xiàn)注射大量的MSCs的小鼠其纖維化程度明顯重于三個對照組(P<0.05)。但其肝功能(主要是AST)卻有一定的改善,這說明MSC來到肝臟中加速纖維化的形成,是對損傷的一種修復(fù)反應(yīng),可以在一定程度上可以改善肝功能。
　　 三、纖維化形成過程中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的動

19、員
　　 1.肝損過程MSCs向肝臟動員募集的時間
　　 想了解BM-MSCs向肝臟趨化的具體機(jī)制,首先要知道MSCs趨化的時間,從兩種動物模型冰凍切片的結(jié)果看,MSCs動員的時間在第3周左右。而隨著時間的推移這種動員程度也在增加。
　　 2.篩選肝纖維化形成過程中起主要作用的趨化因子及其受體。
　　 realtime-PCR法檢測到小鼠MSCs細(xì)胞主要表達(dá)CCR1,CCR2,CCR5,CCR7,CXCR

20、4,CXCR6等6中趨化因子受體,而對應(yīng)這些趨化因子受體,我們檢測到肝損后肝臟主要分泌的趨化因子有CCR1的配體MIP1α,MIP1β;CCR5的配體RANTES,但升高最為明顯的是CXCR4的配體SDF-1α,因此我們認(rèn)為在肝纖維形成過程中促使MSCs趨化最為重要的是SDF-1α/CXCR4趨化軸。
　　 3.驗證SDF-1α/CXCR4趨化軸對MSCs的趨化募集作用
　　 結(jié)果顯示肝損過程中小鼠肝臟的SDF-1α的表

21、達(dá)逐漸增高,而骨髓SDF-1α的表達(dá)略有降低,當(dāng)肝臟中SDF-1α濃度高于骨髓形成濃度梯度時,才能從骨髓中動員出大量的MSCs細(xì)胞,這也解釋了為什么到第3周時,才能看到大量的綠色熒光蛋白出現(xiàn)于肝臟中。而Transwell的結(jié)果也顯示在體外SDF-1α的確對MSCs有很強的趨化作用。
　　 四、肝纖維化形成過程中VEGF促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的機(jī)制研究
　　 結(jié)果顯示在肝損過程中,肝臟有大量的VEGF的產(chǎn)生和分泌,其可以

22、隨血液分布于全身各處。外源性注射VEGF可以增加受體小鼠骨髓中EGFP-MSCs的含量,而這種效應(yīng)可以被VEGF的單克隆抗體Avastin逆轉(zhuǎn)。Transwell試驗和劃痕試驗的結(jié)果顯示VEGF影響MSC的遷移趨化的能力不強(P>0.05)。這說明VEGF在MSC的動員中主要的作用是促進(jìn)MSCs的增殖,而不是MSCs的遷移。
　　 [結(jié)論]
　　 1.肝損過程中,間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)纖維化的形成,至少是促進(jìn)早期肝纖維化的形成

23、。
　　 2.早期的肝纖維化形成主要因為是肝損傷的修復(fù),因此如果人為的加速肝臟修復(fù)促進(jìn)早期肝纖維化的形成,可以相應(yīng)改善肝功能。
　　 3.肝損過程中,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的動員,主要依賴于SDF1α/CXCR4趨化軸,肝臟和骨髓SDF1α濃度的變化決定著MSCs的走向。此趨化軸是MSCs轉(zhuǎn)移出骨隨進(jìn)入循環(huán),向受損部位趨化,募集的主要影響因素之一。
　　 4.肝纖維化中MSCs向受損部位趨化是一個持續(xù)的過程,在人肝硬化