食品功能microRNA富集與制備研究.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度在19-25個(gè)堿基長(zhǎng)的，單鏈非編碼RNA；其特點(diǎn)是進(jìn)化上保守，存在形式多樣，在基因中的位置也保守；其擔(dān)負(fù)著1/3以上的基因表達(dá)調(diào)控功能。有研究表明，在哺乳動(dòng)物血漿中發(fā)現(xiàn)了多種成熟的miRNA，這些miRNA分子在分離提取后比一些大分子量RNA穩(wěn)定的多。然而，人們一直認(rèn)為攝食的核酸成分，在消化到分解為單核苷酸，甚至分解為堿基后被小腸吸收，對(duì)于miRNA的穩(wěn)定性，和功能性質(zhì)值得研究。因此，從食品科學(xué)的

2、角度出發(fā)，系統(tǒng)的研究攝食miRNA對(duì)機(jī)體的作用和健康的影響很重要。我們的目的是獲取大量可食用的miRNA原料。如果能收集到自然界穩(wěn)定存在的miRNA，對(duì)在食品領(lǐng)域研究miRNA的功能性質(zhì)有很大的理論和實(shí)際意義。
　　本論文研究的目的包括以下三方面的內(nèi)容：(1)從魚糜生產(chǎn)廢料中提取miRNA，通過(guò)醇沉濃縮，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)提取的miRNA分子及其含量。(2)設(shè)計(jì)凝膠膜液態(tài)電泳裝置以富集miRNA，以FITC熒光標(biāo)記的ssDNA

3、分子作為指示樣品，摸索富集裝置穩(wěn)定工作的條件。(3)建立通用RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，用生物酶法大量制備目的miRNA。
　　用低毒性的RNA提取液(內(nèi)含多種陰離子表面活性劑)，水浴100℃，提取15-20min得到的RNA，相比普通RNA提取方法得到的大片段RNA含量低，提取的小分子RNA的比例高。在食品加工廢液體系中小RNA比大分子RNA穩(wěn)定的多。我們期望找到有效的方法對(duì)小RNA進(jìn)行富集。
　　本文設(shè)計(jì)了特殊的凝膠膜電泳富集miR

4、NA的富集模型，且凝膠膜可更換。首先對(duì)電泳裝置穩(wěn)定工作的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)摸索，我們確定電壓為300 V,在低離子濃度電泳緩沖液(0.2xTBE或更低)時(shí)進(jìn)行電泳。正極體積是負(fù)極的1/10，電泳時(shí)間定為40 min。通過(guò)凝膠膜電泳相當(dāng)于把小RNA的濃度濃縮了原來(lái)的10倍。魚糜漂洗廢液中含有的核酸成分復(fù)雜，除小分子RNA遷移到膜的另一端，大分子降解物也遷移過(guò)膜。
　　通用型RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，利用含T7啟動(dòng)子的通用接頭序列，在T4 DNA連接

5、酶作用下，連接成轉(zhuǎn)錄模板，再通過(guò)T7RNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄出了帶有一小段啟動(dòng)子序列的miRNA。再經(jīng)DNAzyme切割得到我們的目的RNA序列。通過(guò)環(huán)化含DNAzyme活性中心的鏈，控制了核酸酶切割RNA的活性，為緩慢得到成熟miRNA提供了依據(jù)。
　　本論文對(duì)miRNA的富集與制備進(jìn)行了初步研究，建立了miRNA富集裝置模型，同時(shí)，用通用RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成了miRNA。具體結(jié)論如下：首先，提取到了魚糜漂洗廢液中穩(wěn)定存在的miRNA，

6、但濃度低。其次，設(shè)計(jì)并成功建立了液態(tài)凝膠膜電泳富集miRNA小試裝置。得到了裝置工作穩(wěn)定的條件：電壓300V,低電泳緩沖液濃度(0.2xTBE)。首先成功富集到了指示樣品ssDNA，當(dāng)以魚糜漂洗廢液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，也得到了預(yù)期的效果：除小RNA遷移過(guò)膜到正極端，降解的核酸片段也遷移過(guò)膜進(jìn)入了正極體系。再次，建立了通用RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)：高效連接得到miRNA的轉(zhuǎn)錄模板，T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出可觀的中間產(chǎn)物，借助DNAzyme成功切出了大量的目的m