microRNA-125b的功能研究.pdf

1、背景
　　microRNA（miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度僅為18-25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，成熟miRNA的5’非翻譯區(qū)的2-7個核苷酸的“種子序列”可以與靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)互補結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制靶基因的表達。1993年，首個microRNAlin-4被發(fā)現(xiàn)，從此揭開了對microRNA研究的序幕。隨后，許多實驗室從線蟲、果蠅、家鼠、擬南芥及人類等多種真核生物中發(fā)現(xiàn)了至少500種這類小分子RNA，其中

2、在人類染色體上就有300余種，占人類基因的1-4％。miRNA的編碼基因是目前最大的一類調(diào)節(jié)基因。它在細(xì)胞的生長、增殖、發(fā)育和凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，并與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。miRNA在腫瘤中發(fā)揮著相當(dāng)于癌基因或抑癌基因的作用，調(diào)節(jié)著腫瘤細(xì)胞的多種重要生物學(xué)行為。
　　原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率高、惡性程度高、預(yù)后差的惡性腫瘤之一，它的發(fā)病是多因素導(dǎo)致的復(fù)雜過程。對于肝癌發(fā)生、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移分子機制的探討依然是目前腫瘤分子生

3、物學(xué)研究領(lǐng)域最為重要的問題。與其它惡性腫瘤一樣，肝癌的發(fā)生與發(fā)展是包括原癌基因激活或/和抑癌基因失活的多階段多步驟的過程。在此過程中，基因突變、染色體擴增等基因遺傳學(xué)的改變無疑發(fā)揮著極其重要的作用。除此之外，表觀遺傳學(xué)的改變，尤其是microRNA表達改變造成的原癌基因的失活或抑癌基因的沉默也同樣發(fā)揮著重要作用。
　　目前發(fā)現(xiàn)很多miRNAs在肝癌中異常表達，并在肝癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。例如，miR-122是一個肝臟特異

4、性miRNA，在肝臟發(fā)育以及肝臟正常功能的維持中發(fā)揮調(diào)節(jié)。與正常肝組織相比，肝癌組織中miR-122的表達明顯下調(diào)；而肝癌細(xì)胞中的miR-221/222的表達卻明顯升高，miR-221/222可以通過抑制其靶基因-抑癌基因CDKN1B/p27和CDKN1C/p57而發(fā)揮作用。隨著研究的不斷深入，越來越多的miRNA被證明在肝癌的進展中發(fā)揮重要作用，而鑒定這些miRNA，明確其發(fā)揮作用的靶基因和分子機制，無疑對于人們早日闡明惡性腫瘤的病理

5、機制、發(fā)掘潛在的腫瘤診治靶標(biāo)、研發(fā)新的惡性腫瘤的分子診斷和治療方法具有重要意義。
　　在本研究中，參考國內(nèi)外相關(guān)文獻報道肝癌miRNA表達譜的研究結(jié)果，結(jié)合生物信息學(xué)分析，初步確定miR-125b為我們的研究重點。目的
　　首先明確miR-125b在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中的表達水平，在此基礎(chǔ)上進一步明確miR-125b在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)意義，分析并驗證其發(fā)揮作用的靶基因，探索其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能的分子作用機制。
　

6、　方法
　　1.檢測miR-125b在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中的表達水平。
　　收集9例肝癌患者腫瘤及周圍非瘤組織手術(shù)標(biāo)本，6株肝癌細(xì)胞系及一株永生化肝細(xì)胞系，經(jīng)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-125b的表達水平。
　　2.構(gòu)建miR-125b真核表達載體，通過慢病毒包裝系統(tǒng)獲得過表達miR-125b的毒液，繼而攻擊肝癌細(xì)胞，并通過流式分選獲得高純度的過表達miR-125b的肝癌細(xì)

7、胞株。3.通過MTT、克隆形成、裸鼠體內(nèi)成瘤實驗、流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst33342細(xì)胞染色等檢測miR-125b過表達對細(xì)胞增殖、凋亡的影響。
　　4.通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)、Westernblot及免疫組化技術(shù)探討miR-125b的靶基因。結(jié)果
　　1.分別檢測了9例肝癌組織及配對的癌旁組織、6株肝癌細(xì)胞系及一株永生化肝細(xì)胞系L-02中miR-125b的表達水平，發(fā)現(xiàn)在大部分肝癌組織（7/9）和肝癌細(xì)胞系（5/6）中m

8、iR-125b表達水平降低。
　　2.成功構(gòu)建了miR-125b真核表達載體pHRS-1cla-miR-125b-CMV-EGFP，測序正確，繼而經(jīng)基因轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定過表達miR-125b的肝癌細(xì)胞株。MTT、克隆形成實驗及裸鼠皮下成瘤實驗證實miR-125b抑制了肝癌細(xì)胞的體內(nèi)體外增殖能力；流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst33342細(xì)胞染色證實miR-125b促進了正常培養(yǎng)的及化療藥物誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的凋亡。
　　3.Western

9、blot發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達miR-125b的肝癌細(xì)胞株Bcl-2蛋白的表達水平較對照組細(xì)胞明顯降低；裸鼠皮下成瘤實驗獲得的腫瘤組織經(jīng)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)過表達miR-125b的肝癌細(xì)胞所致的腫瘤組織中Bcl-2蛋白的表達水平同樣較對照組腫瘤組織明顯降低。
　　4.構(gòu)建pGL3-Bcl-2-UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒，與PHRS-1cla-miR-125b-CMV-EGFP真核表達載體共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞后，熒光素酶報告基因活性明顯降低，表