黑米花色苷對CCl-,4-誘導小鼠肝損傷的保護作用及其抗氧化機制.pdf

1、近20年來，評價和篩選具有強抗氧化活性的天然資源已成為生物學、醫(yī)學和食品科學研究的新趨勢。黑米作為重要的優(yōu)異稻種資源，因其糙米（穎果）果皮和種皮內富集有天然花色苷化合物，是開發(fā)天然抗氧化劑的重要來源。自由基是造成肝臟損傷的一個主要因素。目前，肝損傷的防治仍是一個全球性的嚴峻課題，篩選保肝藥物或食物具有十分重要的現(xiàn)實意義。本實驗室發(fā)現(xiàn)黑米花色苷有較強的清除自由基作用，因此本文在探討了黑米花色苷（BRA）分離純化工藝的基礎上，采用HPLC法

2、鑒定了其主成分，通過建立亞急性小鼠肝損傷模型，探討了BRA對四氯化碳（CCl4）誘導小鼠的肝損傷的保護和氧化應激的影響，結合其體外清除自由基抗氧化活性和對CCl4誘導的L-02肝細胞損傷的保護，從抗氧化的角度探討了BRA對肝損傷保護作用的主要機制。主要研究結果如下：
　　 1.BRA的分離純化及其成分鑒定研究：研究大孔樹脂對BRA的吸附純化，并采用HPLC分析純化前后BRA花色苷種類和含量。結果表明：AB-8大孔樹脂對BRA有較

3、好的分離純化效果，其最佳工藝參數為，上柱液pH=2，樣品濃度1.0mg/ml，吸附流速1.0ml/min，以70％乙醇為解吸劑，洗脫速度1.0ml/min。在該條件下，樹脂的重復利用率好，使用5次后吸附率無顯著性差異，使用7次后，吸附率僅降低2.58％。BRA經AB-8大孔樹脂純化后，總抗氧化能力提高3.99倍。通過比照標準品，分析BRA中矢車菊素-3-葡萄糖苷（C3G）為36.98％、芍藥定-3-葡萄糖苷（Pn3G）為4.88％、天竺

4、葵色素-3-葡萄糖苷為（Pg3G）2.76％，分別占總花色苷總含量為82.88％、10.94％和6.18％。
　　 2.BRA對CCl4亞急性小鼠肝損傷的的保護和氧化應激的影響：研究了BRA對CCl4小鼠亞急性肝損傷的保護及抗氧化作用，分析小鼠血清肝酶活性和氧化．抗氧化水平，并通過HE染色觀察肝組織病理學變化。結果表明：小鼠攝入BRA后的低（0.40g/kg bw）、中（0.80g/kg bw）、高（1.60g/kg bw）劑量

5、組經CCl4誘導的亞急性肝損傷小鼠的ALT、AST活性較模型組顯著降低，血清和肝臟中MDA的生成量顯著減少，SOD、GSH-Px活性明顯增強，肝臟組織的總抗氧化能力（T-AOC）顯著提高；攝入高劑量BRA，8-OHdG的含量顯著降低；由CCl4引起的肝臟組織氣球樣變、脂肪變性，炎癥浸潤等病理學損傷，喂食BRA后，均可得到明顯改善。
　　 3.BRA的體外清除自由基抗氧化活性研究：比較了不同化學體系中經大孔樹脂AB-8純化前黑米花

6、色苷粗提物CBRA（CBRA）和純化后BRA的抗氧化活性，并分析了BRA中3種主要花色苷單體C3G、Pn3G、Pg3G的抗氧化能力大小。結果表明：BRA具有一定的還原能力和抗氧化活性，對DPPH·有較好的清除作用，BRA比CBRA顯示出更強的上述活性。當濃度為0.025g/L時，BRA總抗氧化值為1.993mmol/g，是CBRA的3.99倍。CBRA清除DPPH·的IC50值為22μg/ml，BRA清除DPPH·的IC50值為121μ

7、g/ml。3種花色苷單體總抗氧能力表現(xiàn)為C3G>Pg3G>Pn3G，當濃度為0.1g/L時，C3G的TAC值為1.299，Pg3G的TAC值為0.173，Pn3G的TAC值為0.112，三者差異極顯著。3種花色苷單體清除DPPH·能力表現(xiàn)為C3G>Pg3G>Pn3G，三者清除DPPH·能力IC50分別為2.50μg/ml、14.00μg/ml和25.40μg/ml，差異達極顯著水平。
　　 4.BRA對人胚胎肝細胞株L-02 C

8、Cl4損傷的保護作用研究：通過建立CCl4對人胚胎肝細胞株L-02的損傷模型，研究了不同劑量BRA及其3個單體C3G、Pg3G、Pn3G對CCl4損傷的L-02肝細胞損傷的保護作用，結果表明：CCl4誘導小鼠肝細胞損傷的最適損傷濃度為20mmol/L，損傷時間為6 h。經CCl4損傷后模型組細胞存活率僅為45.68％，上清液肝酶活性顯著升高，抗氧化活性呈降低趨勢，脂質過氧化產物MDA和NO含量顯著增加。BRA可一定程度地改善肝細胞L-0

9、2損傷，能明顯提高肝細胞的存活率，且濃度越高，效果越好，存在明顯劑量效應關系，能減少CCl4所致肝酶ALT、AST的釋放，并表現(xiàn)劑量效應。BRA中的3種花色苷單體C3G、Pg3G、Pn3G，對CCl4損傷亦表現(xiàn)出不同程度的保護性抑制作用，主要表現(xiàn)在一是提高細胞存活率，且濃度越高，效果越好，其中C3G使細胞存活率最高達88.56％，比模型組提高94.89％。相同濃度的花色苷，C3G對CCl4所致肝細胞損傷的保護作用最強，且作用效果C3G>

10、Pg3G>Pn3G。二是不同程度地拮抗CCl4造成的L-02細胞轉氨酶ALT、AST的釋放。80μg/ml花色苷作用時，3種花色苷單體均能顯著性降低AST、ALT活性，且3者差異顯著，C3G組細胞AST、ALT活性下降至66.56U/L、53.18U/L，分別是Pg3G組AST、ALT活性的84.22％、66.95％，是Pn3G組AST、ALT活性的91.23％、65.00％。在同濃度下，花色苷對CCl4誘導肝細胞損傷肝酶活性的抑制作用

11、的總體趨勢是C3G>Pg3G>Pn3G。
　　 5.BRA對CCl4損傷人胚胎肝細胞株L-02氧化應激的影響及其護肝機制研究：研究了不同劑量BRA及其3個單體C3G、Pg3G、Pn3G對CCl4損傷的L-02肝細胞氧化應激的影響，結果表明：加入BRA預先孵育，能降低細胞NO含量，提高肝細胞抗氧化水平。80μg/mlBRA作用時，能顯著降低CCl4引起的NO含量的增加；20μg/mlBRA作用，能顯著降低細胞MDA含量；BRA還能

12、顯著升高GSH含量，當劑量達到120μg/ml時，細胞GSH水平升高，接近未經CCl4處理的正常對照組。同時，BRA能顯著改善SOD和CAT酶活的降低，作用劑量越高，改善作用越明顯。BRA中的3種花色苷單體C3G、Pg3G、Pn3G，對CCl4損傷的肝細胞抗氧化體系亦表現(xiàn)出不同程度的保護性增強作用，主要表現(xiàn)在一是能降低NO含量。當C3G濃度達80μg/ml時，NO含量明顯降低，Pg3G和Pn3G對NO的生成量影響不明顯。3種花色苷單體中

13、，只有C3G表現(xiàn)出對NO生成的抑制作用。二是不同程度地拮抗CCl4造成的L-02細胞MDA含量的增加。當花色苷作用劑量為40μg/ml時，C3G和Pg3G組顯著降低MDA含量，差異顯著，較模型組MDA含量分別降低了23.73％、3.96％，而Pn3G組不明顯。花色苷對CCl4誘導肝細胞損傷脂質過氧化產物MDA的抑制作用的總體趨勢是C3G>Pg3G>Pn3G。三是能提高GSH含量。當40μg/ml花色苷作用時，C3G能顯著性增加GSH含量

14、，Pg3G和Pn3G無顯著差異。80μg/ml花色苷作用時，C3G和Pg3G能顯著性增加GSH含量，Pn3G對GSH含量無明顯作用?；ㄉ諏Cl4誘導肝細胞損傷GSH含量的增加作用的總體趨勢是C3G>Pg3G>Pn3G。四是能增強SOD和CAT的活性。80μg/ml花色苷作用肝細胞時，3種單體均能顯著增強SOD、CAT活性，C3G組SOD活性值是Pg3G組的1.54倍，是Pn3G組的1.93倍；C3G組CAT活性值是Pg3G組的1.2

15、8倍，是Pn3G組的1.42倍最強?；ㄉ諏寡趸富钚缘脑鰪娦?，C3G>Pg3G>Pn3G。
　　 本文的創(chuàng)新點:
　　 率先發(fā)現(xiàn)并確證了BRA能顯著降低CCl4肝損傷小鼠的肝酶活性，減輕對肝組織病理學損傷，表現(xiàn)明顯的護肝作用，其機制與其提高抗氧化系統(tǒng)的活性、降低脂質過氧化產物MDA的抗氧化作用密切相關。明確BRA的主要花色苷單體為C3G、Pg3G和Pn3G，發(fā)現(xiàn)3種單體在體外不同化學體系具有抗氧化活性，且對CCl

16、4誘導損傷的肝細胞L-02具有一定的保護作用，能提高細胞存活率，降低肝酶活性，提高細胞氧化-抗氧化系統(tǒng)的抗氧化活性。其中，C3G是提高細胞存活率和提高細胞抗氧化水平的主要物質基礎，從而從細胞水平上明確了黑米花色苷護肝的主要機制。
　　 本研究屬現(xiàn)代生命科學研究的前沿問題，對豐富自由基生物學和稻種資源學理論具有重要價值；研究結果對挖掘和利用優(yōu)異稻種資源，擴大黑米作物的種植面積，調整和優(yōu)化農業(yè)結構，提高農業(yè)效率，帶動特色稻米等農產品