微生物轉(zhuǎn)化井岡霉素制備假氨基糖類α-糖苷酶抑制劑的研究.pdf

1、α-糖苷酶抑制劑在糖尿病治療中發(fā)揮著重要作用，井岡胺作為α-糖苷酶抑制劑以及合成降糖藥物的中間體，有著重要的藥用價值和廣闊的市場前景。由于井岡胺的化學(xué)合成工藝復(fù)雜，步驟繁多，利用生物轉(zhuǎn)化制備井岡胺已成為當(dāng)下研究熱點。本論文利用生物農(nóng)藥井岡霉素為原料，對利用微生物轉(zhuǎn)化井岡霉素制備井岡胺進行了系統(tǒng)研究。
　　 本文通過堿水解阿卡波糖的方法制備井岡胺粗品，利用732陽離子交換樹脂和DOWEX1×2陰離子交換樹脂純化井岡胺粗品以制備井岡

2、胺對照品，其得率約為1％。對井岡胺的TLC及HPLC檢測條件進行了優(yōu)化，優(yōu)選出井岡胺的TLC檢測條件為:展開劑:正丙醇∶冰乙酸∶水=4∶1∶1;顯色劑:1％茚三酮溶液。對井岡胺柱前衍生化反應(yīng)條件的研究結(jié)果表明:隨著溫度和時間的增加，衍生化反應(yīng)程度更為充分，最終優(yōu)選出的衍生化反應(yīng)條件為:反應(yīng)體系為:1％對氟硝基苯和1.5％三乙胺的二甲基甲酰胺溶液;反應(yīng)水浴溫度100℃;反應(yīng)時間60min。衍生化產(chǎn)物HPLC檢測的優(yōu)選條件為:色譜柱:Phe

3、nomenex Gemini C18色譜柱;流動相∶乙腈-水(15∶85);柱溫:30℃;流速:1.0ml/min;檢測波長:398nm。
　　 利用采自不同區(qū)域的20份土樣，在井岡霉素作為唯一碳源的培養(yǎng)基中進行轉(zhuǎn)化菌株篩選，從2號土樣中分離出細菌59株，真菌23株。以底物井岡霉素消耗量和產(chǎn)物井岡胺生成量為指標，采用TLC對82種微生物進行初篩，得到2株具有轉(zhuǎn)化井岡霉素生成井岡胺的細菌。再以井岡胺產(chǎn)量為指標進行HPLC復(fù)篩，最終

4、得到一株具有較高轉(zhuǎn)化能力的菌株，編號為V2。
　　 對菌株V2轉(zhuǎn)化井岡霉素產(chǎn)井岡胺的培養(yǎng)基組成和搖瓶發(fā)酵條件進行了初步優(yōu)化，結(jié)果優(yōu)選培養(yǎng)基為:蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化鈉0.5％、磷酸氫二鉀0.7％、磷酸二氫鉀0.3％、無水磷酸鎂0.01％。最佳轉(zhuǎn)化條件為:底物井岡霉素濃度1％，培養(yǎng)液初始pH8.0，培養(yǎng)時間6d，裝液量50/250ml，發(fā)酵溫度34℃，接種量15％。在此轉(zhuǎn)化條件下井岡霉素的消耗量≥99，產(chǎn)物井岡胺的相對

5、轉(zhuǎn)化率為6.29。
　　 利用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗以及分子生物學(xué)方法對菌株V2進行鑒定。通過形態(tài)學(xué)觀察，V2為芽孢桿菌。V2菌株生理生化實驗研究表明，該菌為革蘭氏陰性菌，菌株具有還原硝酸鹽，液化明膠的能力;菌體可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，但不產(chǎn)氣;不可利用檸檬酸鹽;菌體產(chǎn)生淀粉酶，過氧化氫酶;甲基紅反應(yīng)為陰性，VP反應(yīng)結(jié)果不確定。16srDNA測序及測序結(jié)果同源性比對表明菌株V2為芽孢桿菌屬Bacillus。通過構(gòu)建進化發(fā)育樹分析，菌