基于表面原子轉移自由基聚合和納米探針的生物分析新方法.pdf

1、復雜生物樣品中與疾病相關生物分子的靈敏、快速、準確檢測對于研究疾病的發(fā)生發(fā)展、疾病診斷與治療等具有十分重要的意義。但由于在疾病的發(fā)生發(fā)展初期，相關生物分子在組織或血液中表達很低，利用常規(guī)方法無法檢測到，難以實現(xiàn)疾病的早期診斷，因此發(fā)展生物分析新原理新方法，實現(xiàn)生物檢測的信號放大并有效提高檢測靈敏度，是目前生物分析化學領域的熱門課題。本論文圍繞生物分子檢測的信號放大方法需求，基于表面原子轉移自由基聚合和納米探針，開展了以下三個方面的工作:

2、
　　 1、表面原子轉移自由基聚合反應基礎及其生物傳感應用
　　 將引發(fā)劑分子通過共價鍵合的方式與DNA或蛋白質分子偶連，研究固體表面生物分子存在時原子轉移自由基聚合反應原理及基礎條件。進一步利用DNA雜交或夾心免疫反應將標記有引發(fā)基團的生物分子固定到電極或基質表面，選擇具有側鏈功能基團的單體進行原子轉移自由基聚合反應。該聚合反應由引發(fā)基團數(shù)量（固定的標記生物分子數(shù)量）及其外部條件（催化劑、單體量、溫度、溶劑等）控制，當

3、引發(fā)基團數(shù)量（生物分子濃度）確定時，聚合物的生長使成百上千個單體分子聚集形成長鏈聚合物，由于聚合物的側鏈帶有功能基團且能與電化學或光學活性物質發(fā)生鍵合反應，從而顯著增加了單元生物分子識別反應的信號分子負載量，實現(xiàn)了生物分子檢測的信號放大，提高了檢測靈敏度。
　　 基于這種表面原子轉移自由基聚合反應輔助的信號放大方法，成功地構建了四種生物傳感器:
　　 (1) DNA/卵清蛋白(ovalbumin)電化學傳感器。利用DNA

4、雜交或分子特異性識別將標記有引發(fā)基團的DNA檢測探針或ovalbumin固定到電極或金片表面，選擇具有活性羥基的甲基丙烯酸2-羥乙酯(HEMA)或具有環(huán)氧基的甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)單體進行原子轉移自由基聚合反應。橢圓偏振計數(shù)據(jù)表明，金片上形成的聚合物的厚度大約為20 nm。形成的長鏈聚合物的側鏈帶有羥基或環(huán)氧基能與電化學活性物質氨基二茂鐵(FcNH2)發(fā)生鍵合反應，鍵合在聚合物鏈上的二茂鐵衍生物具有靈敏的電化學響應，可用于溶液中

5、DNA/ovalbumin的測定。最優(yōu)實驗條件下，DNA濃度的對數(shù)在濃度為0.1～1000 nM范圍內與電化學信號呈良好的線性關系，其檢測限為15 pM; ovalbumin濃度的對數(shù)在濃度為在0.1～500ng mL-1范圍內與電化學信號呈良好的線性關系，其檢測限為0.07 ng mL-1。
　　 (2)前列腺抗原(PSA)/癌胚抗原(CEA)電化學傳感器。利用夾心免疫反應將標記有引發(fā)基團的PSA或CEA固定到電極或金片表面，

6、以GMA為單體進行原子轉移自由基聚合反應。通過形成的長鏈聚合物側鏈上環(huán)氧基嫁接FcNH2，制得靈敏的PSA/CEA電化學傳感器。最優(yōu)實驗條件下，PSA和CEA濃度的對數(shù)分別在濃度為0.001～40 ng mL-1及0.0005～40 ng mL-1范圍內與電化學信號呈良好的線性關系，其檢測限分別為0.14 pg mL-1和0.10 pg mL-1。制得的傳感器分別對60個PSA和40個CEA臨床血樣進行了檢測，所得結果與臨床電致化學發(fā)光

7、方法得到的結果一致。
　　 (3) PSA電化學和流動注射化學發(fā)光免疫傳感器。利用夾心免疫反應將標記有引發(fā)基團的PSA固定到電極或金片表面，以GMA為單體進行原子轉移自由基聚合反應。利用長鏈聚合物側鏈上豐富的環(huán)氧基團與具有電化學和化學發(fā)光活性的辣根過氧化物酶(HRP)分子中的活性氨基之間的化學反應，將HRP偶聯(lián)在聚合物表面，制得PSA免疫傳感器。最優(yōu)條件下，PSA在濃度為0.0005～20 ng mL-1范圍內分別與電化學信號及

8、流動注射化學發(fā)光信號呈良好的線性關系，其檢測限分別為1.3 pg mL-1和4.0 pg mL-1。電化學信號和流動注射化學發(fā)光信號較傳統(tǒng)的用HRP標記的抗體作為信號分子的檢測信號分別放大了14和13倍。
　　 (4) CEA電致化學發(fā)光(ECL)傳感器。利用夾心免疫反應將標記有引發(fā)基團的CEA固定在電極或金片表面，選擇具有環(huán)氧基的GMA單體進行原子轉移自由基聚合反應，并將具有ECL活性的N,N-二異丙基乙二胺(DPEA)偶聯(lián)在

9、形成的聚合物的側鏈上，制得CEA電致化學發(fā)光傳感器。最優(yōu)實驗條件下，CEA在濃度為0.001～1000 ng mL-1范圍內與ECL信號呈良好的線性關系，其檢測限為0.5 pg mL-1。
　　 基于表面原子轉移自由基聚合反應輔助的信號放大方法構建的生物傳感器具有靈敏度高、選擇性強、檢測范圍寬等優(yōu)點，可用于檢測低濃度的DNA和蛋白質，為腫瘤疾病的早期診斷與治療提供了新途徑。
　　 2、基于納米生物探針的信號放大方法及其在

10、生物傳感中的應用
　　 將信號分子負載在二氧化硅(SiO2)納米粒子表面或包裹在SiO2納米粒子內部，并進一步在其外表面嫁接對生物分子具有選擇性的識別元素，制得納米探針。由于SiO2納米粒子可負載更多的信號分子，從而顯著增加單元生物分子識別反應的信號分子負載量，提高了檢測靈敏度?；诖怂悸罚频昧藘煞N生物傳感器:
　　 (1)甲胎蛋白(AFP)免疫傳感器。首先用種子生長法制得顆粒分散均勻，直徑為100±3 nm的SiO2

11、納米粒子。然后將SiO2納米粒子表面用γ-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPMS)進行硅烷化處理，并一步將HRP和AFP二抗以一定比例共同固定在其表面，制得AFP納米生物探針。最后利用夾心免疫反應將AFP納米生物探針捕獲到電極或金片表面，構建了靈敏的AFP免疫傳感器。最優(yōu)實驗條件下，AFP在濃度為0.05～3 ng mL-1范圍內與電化學信號呈良好的線性關系，其檢測限為0.01 ng mL-1; AFP在濃度為0.01～3 ng mL

12、-1范圍內與流動注射化學發(fā)光信號呈良好的線性關系，其檢測限為0.01 ng mL-1。電化學信號和流動注射化學發(fā)光信號較傳統(tǒng)的用HRP標記的抗體作為信號分子的檢測信號分別放大了29.5和61倍。
　　 (2)凋亡肝癌細胞（HepG2）ECL傳感器。首先用反相微乳法合成了包裹有Ru(bpy)32+的尺寸規(guī)整、直徑大約為50 nm的SiO2納米小球。然后將磷酯酰絲氨酸抗體(APSA)固定在經(jīng)硅烷化處理后的SiO2納米粒子表面，制得納

13、米探針。利用納米探針表面的APSA與修飾在電極上的凋亡HepG2細胞表面上的磷酯酰絲氨酸抗原(PS)之間的免疫反應將上述納米生物探針固定在電極表面，制得靈敏的凋亡HepG2細胞ECL傳感器。最優(yōu)實驗條件下，細胞數(shù)的對數(shù)在800～1.0×107 cells mL-1與ECL信號呈良好的線性關系，并借助于熒光光譜和熒光顯微鏡，評估了抗腫瘤藥物與細胞的相互作用，監(jiān)控了腫瘤細胞表面抗原的動態(tài)變化，并檢測了細胞的異質性。
　　 基于納米探

14、針的信號放大方法制備的生物傳感器操作簡單、價廉、特異性強，為臨床腫瘤標志物的靈敏檢測、藥物篩選和個體用藥提供了新方法。
　　 3、硼酸修飾納米填充柱的制備及其生物傳感應用
　　 在瓊脂糖凝膠或玻璃微球表面嫁接硼酸基團，并填充在毛細管中作為硼酸免疫分析柱，利用硼酸基團對糖類抗原的點位識別作用，建立了血液中糖類抗原的流動注射化學發(fā)光(CL)免疫檢測方法。
　　 (1)玻璃微球為載體的硼酸免疫分析柱。首先將玻璃微球硅烷

15、化，使其表面形成環(huán)氧硅烷單層，并進一步與氨基苯硼酸(APBA)上的氨基之間發(fā)生開環(huán)化學反應，將APBA修飾到玻璃球表面并填充在玻璃管中，利用硼酸基團對糖類抗原AFP的識別作用，將AFP抗原固定在分析柱中，制得硼酸免疫分析柱。然后通過免疫反應，將分析物AFP和辣根過氧化物酶標記的AFP抗體(HRP-anti-AFP)的混合物中游離的HRP-anti-AFP捕獲到分析柱中。最優(yōu)實驗條件下，AFP濃度在10～100 ng mL-1范圍內與CL

16、信號呈良好的線性關系，相關系數(shù)是0.993。
　　 (2)瓊脂糖凝膠為載體的硼酸免疫分析柱。將硼酸瓊脂糖凝膠填充在玻璃管中，利用硼酸基團對糖類抗原AFP的識別作用，將AFP固定到分析柱中，制備成硼酸免疫分析柱。然后通過免疫反應，將溫育溶液中游離的HRP-anti-AFP捕獲到分析柱中。用紫外分光光度計對捕獲的HRP-anti-AFP的活性進行了檢測。最優(yōu)實驗條件下，AFP濃度在5～120 ng mL-1和300～1000 ng