群勃龍的化學修飾及其免疫原性的構建.pdf

1、群勃龍化學名為去甲雄三烯醇酮(17-β-hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one-17-acetate)，是人工合成的甾類男性激素，也是家畜的生長促進劑，人服用這類肉制品同樣會給身體健康帶來危害。此外，群勃龍也成為體育比賽興奮劑的一個可能來源。歐盟禁止進口使用該類產(chǎn)品的食品，也是我國海關禁止檢出的31種獸藥之一。目前，群勃龍在食品中殘留量的檢測主要依賴于質譜技術，如氣相色譜-質譜技術(GC-MS)、液相色譜-質譜技

2、術(LC-MS)等。隨著單克隆抗體技術、分子生物學及現(xiàn)代免疫測定技術的發(fā)展，建立方便于基層檢驗檢疫部門應用的快速、靈敏的群勃龍檢測方法，對從源頭上監(jiān)測、控制此類物質的擴散具有重要意義。群勃龍是小分子化合物，需要與大分子載體(蛋白質)偶聯(lián)后才具有免疫原性。本研究采用琥珀酸酐對群勃龍進行化學修飾，并將獲得的群勃龍-半琥珀酸酯(TR-HS)與BSA偶聯(lián)以賦予其免疫原性，經(jīng)注射家兔分析免疫效果和建立ELISA監(jiān)測方法。
　　 目的：群勃

3、龍(Trenbolone，TR)化學名為去甲雄三烯醇酮(17-β-hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one-17-acetate)，TR是一小分子半抗原物質，為了賦予其免疫原性，對其化學結構作適當修飾并與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)，以期獲得群勃龍完全抗原，繼而制備群勃龍?zhí)禺愋钥贵w和建立群勃龍?zhí)禺愋詸z測方法。
　　 方法：
　　 (1)利用紅外光譜、質譜分析、核磁共振對所購群勃龍原料結構進行鑒定。

4、r>　　 (2)結構的修飾：將群勃龍和琥珀酸酐，以吡啶溶解，80℃攪拌反應3h。反應液冷卻至室溫，調整其pH為3.0，得棕黃色粘稠物，過夜后變硬。用熱的異丙醇重結晶提純，紅外燈烘干即為TR-半琥珀酸酯(TR-HS)，采用質譜法對其分子量進行預測，利用紅外光譜核磁共振對其鑒定。
　　 (3)TR-HS與BSA偶聯(lián)物的制備：采用混合酸酐法和碳化二亞胺法(EDC)，將TR-HS與BSA偶聯(lián)制備成偶聯(lián)物。
　　 混合酸酐法：T

5、R-HS與BSA按摩爾比100∶1反應：取TR-HS5.5 mg溶于2 mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，置4℃冰箱中預冷10 min，于冰浴磁力攪拌，加入三丁胺30μL，再加入氯甲酸異丁酯15μL，然后將該溶液置4℃冰箱中反應1h即為反應液Ⅰ液；取10.0 mg BSA溶于2mL蒸餾水，溶解后于冰浴邊攪拌邊用1 mol/L NaOH調pH為8.5制得Ⅱ液；邊攪拌邊將Ⅰ液緩慢滴加到Ⅱ液中，于4℃攪拌反應過夜。反應產(chǎn)物充分透析，即得

6、TR-BSA偶聯(lián)物溶液，將其冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?br>　　 碳二亞胺法(1-ethy1-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)法：TR-HS與BSA按摩爾比100∶1反應。取TR-HS、NHS、EDC按摩爾比1∶1∶1溶于1ml DMF，混勻后于4℃下活化1h，此為反應液Ⅰ液；取10 mg BSA溶于3mL雙蒸水中，加DMF0.5～1.0ml混勻，4℃預冷20min，得Ⅱ液；邊攪拌邊將Ⅰ液

7、緩慢滴加到Ⅱ液中，于4℃攪拌反應過夜。反應產(chǎn)物充分透析，即得TR-BSA偶聯(lián)物，冷凍干燥保存。
　　 (4)包被抗原：OVA與TR-HS偶聯(lián)所得，方法同BSA與TR-HS偶聯(lián)中的混合酸酐法。
　　 (5)采用MALDI-TOF、紫外光譜法分析偶聯(lián)結果。
　　 (6)TR-BSA免疫家兔制備抗血清將制備的TR-BSA用完全福氏佐劑常規(guī)法免疫家兔，用TR-BSA與不完全福氏佐劑乳化后加強免疫。獲得的免疫血清用ELIS

8、A間接法和雙向免疫擴散，測定特異性抗血清效價，分析其免疫原性和判斷免疫效果。
　　 結果：
　　 (1)本研究所采用TR原料經(jīng)鑒定紅外特征峰與理論相符，核磁共振氫譜、碳譜各根值與理論一致。
　　 (2)群勃龍化學修飾物鑒定。
　　 KBr壓片紅外測試，2974 cm-1為羧基上的O-H不對稱伸縮振動峰，1738 cm-1為骨架六元環(huán)上C=O不對稱伸縮振動峰。氣相質譜顯示的基峰，MS(EI)：m/z=270

9、，此峰為化合峰碎裂形成的最強峰。1HNMR(400 MHz，CDCl3，rt)：δ=0.96(s，3H，CH3)，1.32(m，1H，CH2)，1.54(m，3H，CH2)，1.61(m，1H，CH1)，1.93(d，1H，J=12.4，CH2)，2.27(m，1H，CH1)，2.44-2.60(m，5H，CH2)，2.69-2.72(m，4H，CH2)，2.86(m，2H，CH2)，4.84(t，1H，J=7.6，OCH)，5.81(

10、s，1H，CH)，6.36(d，1H，J=9.6，CH)，6.44(d，1H，J=10.0，CH)，經(jīng)過1H NMR、13C NMR、NMR二維圖、IR、MS確認其結構。
　　 (3)用PRF-S02(ultraflexTOF/TOF)儀器檢測BSA、混合酸酐法制備的TR-BSA，兩者的相對分子量分別為Mr.6,7146和Mr.7,4471。由此估算偶聯(lián)比率為20.8。
　　 (4)紫外/可見分光光度計對BSA、TR-H

11、S、TR-BSA進行掃描測定顯示，混合酸酐法、EDC法所得偶聯(lián)物峰形發(fā)生明顯變化，278nm吸收峰明顯降低，且在343nm處吸收值明顯增大，說明偶聯(lián)是成功的。以20％乙醇為溶劑并以之調零，紫外光度法估算偶聯(lián)比率，混合酸酐法結合比約為1∶18；EDC法結合比約為1∶12。
　　 (5)TR-BSA免疫的家兔血清，經(jīng)ELISA測得TR特異性抗體效價為1∶320000；雙向免疫擴散測得的抗血清效價為1∶16。
　　 結論：