黃酒酵母菌基因變異及其基因敲除突變菌株的構(gòu)建.pdf

1、黃酒是中國(guó)的民族特產(chǎn)，主要以大米、玉米、小麥等為主要原料，利用麥曲中的多種微生物發(fā)酵而成的釀造酒。黃酒含有豐富的氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，具有易于消化，舒筋活血、美容抗衰老、促進(jìn)食欲、保護(hù)心臟等功能。在黃酒發(fā)酵過(guò)程中，釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）是其中的關(guān)鍵微生物對(duì)發(fā)酵起主導(dǎo)作用。在黃酒發(fā)酵過(guò)程中，酵母細(xì)胞會(huì)受到高溫、高滲透壓、低pH等環(huán)境因子的脅迫，當(dāng)脅迫條件超過(guò)釀酒酵母的生理極限時(shí)，就會(huì)抑制細(xì)胞的正常生長(zhǎng)

2、代謝及酒精的發(fā)酵效率。因此黃酒酵母對(duì)環(huán)境脅迫的耐受機(jī)理的研究對(duì)黃酒發(fā)酵工業(yè)至關(guān)重要。
　　本研究前期已經(jīng)篩選出一株具有高耐受性的黃酒酵母，并分離獲到其單倍體D2。通過(guò)對(duì)這一株具有優(yōu)良抗逆性能的黃酒酵母菌的基因組進(jìn)行測(cè)序，并與模式實(shí)驗(yàn)菌株S288c進(jìn)行比較分析，鑒定出了一些在黃酒酵母菌中存在，但不在實(shí)驗(yàn)菌株S288c存在的新基因，例如新基因g5170。同時(shí)也鑒定出黃酒酵母中缺失的一些基因，例如AAD10基因。
　　為了研究新基

3、因g5170對(duì)菌株發(fā)酵及乙醇耐受性的影響，本研究利用Cre/loxP系統(tǒng)構(gòu)建此基因的敲除菌株，并對(duì)基因敲除菌株與原始菌株進(jìn)行耐受性比較分析。實(shí)驗(yàn)通過(guò)擴(kuò)增帶有g(shù)5170基因上下游同源序列和Kanr篩選標(biāo)記的g5170基因敲除組件，轉(zhuǎn)化到釀酒酵母D2獲得陽(yáng)性克隆子，然后將質(zhì)粒pSH65轉(zhuǎn)到陽(yáng)性克隆子中，半乳糖誘導(dǎo)pSH65表達(dá)Cre酶切除Kanr篩選標(biāo)記，獲得g5170等位完全缺失菌株D2-Δg5170。
　　耐受性分析表明兩菌株對(duì)高

4、溫和高糖的耐受性相同，但對(duì)高濃度乙醇，原始菌株D2比基因敲除菌株D2-Δg5170表現(xiàn)出較高的耐受性。菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)比較結(jié)果也表明D2-Δg5170比D2對(duì)高濃度酒精環(huán)境的耐受性低。為驗(yàn)證基因敲除菌株對(duì)乙醇脅迫耐受性的影響，進(jìn)一步比較基因敲除菌株與原始菌株在8％乙醇作用不同時(shí)間后的存活率。在乙醇處理2，4，6，8小時(shí)后，基因敲除菌株相對(duì)原始菌株的存活率都降低了約1.16-1.71倍。同時(shí)模擬黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺失菌株D2-Δg5170