布拉酵母菌VRP1基因缺失株構(gòu)建及其益生功能的研究.pdf

1、布拉酵母菌(Saccharomyces. boulardii)是1920年由法國科學(xué)家Henri Boulard從印尼荔枝等水果中分離得到的一種益生性酵母菌。在歐美、非洲等國家地區(qū)，布拉酵母菌（Sb）已經(jīng)做為微生態(tài)制劑廣泛用于預(yù)防和治療嬰幼兒腹瀉、旅行者腹瀉、腸道手術(shù)后恢復(fù)及腸道環(huán)境平衡的調(diào)節(jié)。布拉酵母菌已經(jīng)成為最有價(jià)值的益生菌之一。對布拉酵母菌大量研究主要集中在生產(chǎn)和臨床使用，對其抗炎及免疫調(diào)節(jié)的分子機(jī)制研究相對較少，以及對其遺傳改造

2、以提高其益生作用和效果也少有研究和報(bào)道。為了研究布拉酵母菌抗炎作用及提高其益生效果，我們通過敲除布拉酵母菌VRP1基因，構(gòu)建β-葡聚糖含量升高的缺失變異菌株，對比研究THP1基因缺失突變株（Sb-thp1）和VRP1基因缺失變異株（Sb-vrp1）的形態(tài)大小、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、生長速度等表型，對基因缺失突變株進(jìn)行安全性評價(jià)，通過DSS腸炎來研究布拉酵母菌及其缺失變異株預(yù)防腸炎能力，篩選益生能力較好的菌株，并對益生機(jī)制進(jìn)行探討。
　　1.

3、布拉酵母菌VRP1基因缺失變異株的構(gòu)建
　　酵母菌β-葡聚糖占母菌細(xì)胞壁組成的50％以上，是一種很好的天然免疫增強(qiáng)劑，能提高機(jī)體的非特異性和特異性免疫作用，因此構(gòu)建、篩選高含量β-葡聚糖的布拉菌變異株能豐富β-葡聚糖的自然資源，拓寬布拉酵母菌應(yīng)用領(lǐng)域。我們應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室布拉酵母菌Cre-loxP基因敲除系統(tǒng)，把VRP1基因從布拉酵母菌基因組中完全刪除，利用PCR鑒定基因敲除株，獲得VRP1基因缺失變異株。
　　2.布拉酵母菌及

4、其基因缺失變異株的表型研究
　　我們對布拉酵母菌野株及其基因缺失變異株表型進(jìn)行對比研究，包括形態(tài)大小、細(xì)胞壁組成、生長速度、細(xì)胞壁敏感性、體外對人工胃酸、膽汁鹽的耐受性及小鼠體內(nèi)滯留情況等。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與Sb比較，Sb-thp1變圓，而Sb-vrp1變得細(xì)長。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與Sb、Sb-thp1相比，Sb-vrp1總細(xì)胞壁厚度分別增加13.4%和10.7%；甘露聚糖單層厚度分別增加25.1%和19.5%；葡聚糖單層厚度分

5、別增加10.9%和4.2%。與Sb相比，Sb-vrp1生長速度無差別，Sb-thp1生長速度減慢。在對剛果紅的敏感性上，Sb、Sb-thp1和Sb-vrp1細(xì)胞壁之間比較沒有差別。在體外抗不同pH胃酸試驗(yàn)中，Sb、Sb-thp1和 Sb-vrp1存活率比較差異不顯著；在體外抗不同濃度膽汁鹽試驗(yàn)中，Sb-vrp1存活率顯著高于Sb和Sb-thp1。小鼠體內(nèi)滯留試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與Sb比較，Sb-thp1和Sb-vrp1滯留時(shí)間分別多8h和12h。

6、綜上所述，從布拉酵母菌基因組敲除VRP1和THP1基因會對布拉酵母菌表型產(chǎn)生一定程度的影響。
　　3.布拉酵母菌基因缺失株安全性評價(jià)
　　通過急性毒性試驗(yàn)和慢性重復(fù)性試驗(yàn)，對基因缺失株Sb-vrp1與Sb-thp1進(jìn)行安全性評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因缺失株Sb-vrp1與Sb-thp1在一次性大劑量（2×109個(gè)菌）急性毒性試驗(yàn)中，動物臨床表現(xiàn)、體重變化、臟器及血液指標(biāo)等方面與正常組沒有差別，機(jī)體沒有表現(xiàn)出任何毒性反應(yīng)。將基因缺失

7、株Sb-vrp1與Sb-thp1分高（2×108個(gè)菌）、中（1×108個(gè)菌）、低（2×107個(gè)菌）三種劑量，每天灌服小鼠，連續(xù)進(jìn)行二十八天的慢性重復(fù)性毒性試驗(yàn)。與對照組比較，基因缺失株各劑量組，在臨床表現(xiàn)、體重變化、臟器及血液指標(biāo)等方面沒有區(qū)別。另外，同一菌種，劑量高低對機(jī)體正常生理、血液指標(biāo)沒有影響，而且同一劑量的不同菌株，也沒有表現(xiàn)出差別。以上這些結(jié)果表明基因缺失株Sb-vrp1與Sb-thp1對小鼠是安全的。
　　4.DSS

8、結(jié)腸炎動物模型的建立
　　DSS急性結(jié)腸炎動物模型是研究人自然結(jié)腸炎常用的模型，重復(fù)性好，容易操作，被廣泛使用。為了研究布拉酵母菌及其缺失變異株預(yù)防治療結(jié)腸炎的作用，我們選擇6周齡C57BL/6J雌性小鼠為試驗(yàn)動物，來建立DSS結(jié)腸炎動物模型，對DSS使用劑量、檢測指標(biāo)進(jìn)一步試驗(yàn)，探討最佳的試驗(yàn)條件。結(jié)果表明，3%DSS連續(xù)飲用8天能成功建立DSS急性結(jié)腸炎動物模型；以疾病活動指數(shù)和病理組織學(xué)得分作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)來評價(jià)DSS結(jié)腸炎；疾

9、病活動指數(shù)是體重?fù)p失得分與潛血得分的平均數(shù)。當(dāng)體重沒有變化或者上升時(shí)，體重?fù)p失得分為0；當(dāng)體重下降1?5%，體重?fù)p失得分為1；當(dāng)體重下降5?10%，體重?fù)p失得分為2；當(dāng)體重下降10?15%，體重?fù)p失得分為3；當(dāng)體重下降超過15%，體重?fù)p失得分為4。糞便正常均一沒有潛血，潛血得分為0；糞便柔軟帶有潛血，潛血得分為1；非常柔軟并帶有血跡，潛血得分為2；糞便水樣帶有可見直腸出血，潛血得分為3；嚴(yán)重血便，潛血得分為4。病理組織學(xué)得分根據(jù)淋巴細(xì)胞

10、侵潤和上皮黏膜損傷程度來計(jì)算。沒有淋巴細(xì)胞侵潤和腸道上皮黏膜完整正常，病理組織得分為0；有少量的淋巴細(xì)胞侵潤，病理組織得分為1；中性粒細(xì)胞侵潤和黏膜輕度水腫，病理組織得分為2；腸道黏膜局灶性糜爛和潰瘍，病理組織得分為3；腸道黏膜大的多處潰瘍，病理組織得分為4；腸道黏膜結(jié)構(gòu)完全破壞，病理組織得分為5。
　　5.布拉酵母菌及其基因缺失變異株對DSS結(jié)腸炎的預(yù)防作用
　　我們通過DSS結(jié)腸炎模型來研究布拉酵母菌及其基因缺失變異株對

11、DSS結(jié)腸炎的預(yù)防作用。對4周齡C57BL/6J雌性小鼠每只每天分別灌胃108個(gè)布拉酵母菌及其基因突變變異株，連續(xù)進(jìn)行22天，從第14天開始連續(xù)8天使用3%DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎，觀察布拉酵母菌及其基因缺失突變株預(yù)防作用。我們分析了布拉酵母菌及其基因缺失突變株對DSS腸炎預(yù)防效果，對小鼠炎癥因子和屏障相關(guān)基因表達(dá)及免疫系統(tǒng)的影響。Sb-vrp1和Sb-thp1能夠下調(diào)DSS結(jié)腸炎疾病活動指數(shù)，減輕結(jié)腸病理組織損傷，緩解結(jié)腸病變，并能使脾臟指數(shù)

12、和MPO酶活力接近于對照組。通過RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)Sb-vrp1能下調(diào)結(jié)腸中促炎因子IL-6、IL-17、iNOS、TNF-α、MMP-2和MMP-9等基因表達(dá)，上調(diào)MUC-2、ZO-1和 Occludin等腸道屏障相關(guān)基因的表達(dá)，從而達(dá)到減輕炎癥，增強(qiáng)腸壁的屏障作用，來達(dá)到預(yù)防效果。
　　布拉酵母菌及其基因缺失變異株能夠調(diào)節(jié)抗體水平，其中Sb-vrp1使正常小鼠SIgA濃度水平升高175%，使DSS腸炎小鼠SIgA濃度水平升