一個新型Group 2 Mrp系統(tǒng)的基因克隆、功能鑒定及其基因敲除菌株的構(gòu)建.pdf

1、松嫩鹽單胞菌（Halomonas songnenensis）NEAU-ST10-39T是從中國的黑龍江省松嫩鹽堿地篩選得到的生長范圍為0.2-15％(w/v)的NaCl(最適為4％，w/v)和pH5-10(最適為pH7)的一株中度嗜鹽菌（Moderate halophile）。那么，它可能進化了復雜的耐鹽堿基因及其調(diào)節(jié)機制，以保持其細胞內(nèi)穩(wěn)定的滲透壓和離子平衡。因此，在該菌株中很可能存在豐富的Na+（Li+）/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白在與耐鹽堿

2、方面起著重要作用，因此，以松嫩鹽單胞菌（Halomonas songnenensis）NEAU-ST10-39T作為細菌耐鹽堿基因挖掘的研究對象，獲得重要的或新的耐鹽堿基因的幾率更大。
　　本論文從基因文庫的構(gòu)建方法入手，結(jié)合鹽離子耐受特性功能互補的方法，借助大腸桿菌（Escherichia coli）Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白缺陷株KNabc（△nhaA，△nhaB，△chaA），從松嫩鹽單胞菌（H.songnenensis）NE

3、AU-ST10-39T中克隆獲得一個編碼多亞基單價陽離子/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白(multisubunit monovalent cation/proton antiporter)的mrp操縱子。耐鹽堿實驗表明，mrp操縱子能夠賦予大腸桿菌KNabc對0.8 M NaCl，120 mM LiCl和堿性pH的耐受性。序列分析及蛋白同源比對結(jié)果表明此mrp操縱子包含有六個完整的開放閱讀框，為Group2型mrp操縱子，我們沿用mrp這一名稱，又因

4、其來自松嫩鹽單胞菌（H.songnenensis）NEAU-ST10-39T而被定名為Hs_mrp2。
　　Hs_mrp2操縱子全長6，709 bp，包含6個完整的開放式閱讀框架(ORF1-6)，并且ORF1-6擁有一個共同的啟動子和終止子，每個閱讀框上游都有各自的SD序列。蛋白同源性比對結(jié)果表明，Hs_mrp2的六個亞基A'～G與來自鹽單胞菌（Halomonaszhanjiangensis）中推測的Group2型Mrp的六個亞基

5、的同源性最高(88.4％ to97.2％)。目前，已鑒定的Group2型Mrp僅有兩個，并且Hs_Mrp2的各亞基與這兩個已經(jīng)鑒定的Group2型Mrp包括Sm_Pha1（來自Sinorhizobium meliloti）和Vc_Mrp（來自Vibrio cholerae）的MrpA'～G亞基具有相對較低的同源性，分別為28.7％～50.9％和25.9％～41.8％。以上結(jié)果暗示，Hs_mrp2可能編碼一個新型的Group2型Mrp系統(tǒng)

6、，是目前在中度嗜鹽菌屬中發(fā)現(xiàn)的首個Group2型Mrp。隨后，我們用Hs_mrp2與已經(jīng)鑒定和部分未鑒定的Group1型Mrp和Group2型Mrp利用鄰接算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，構(gòu)建結(jié)果表明Hs_mrp2與推測的Hz_mrp2形成一個獨立分支而與所有已鑒定的Group1型Mrp和Group2型Mrp相距較遠，初步證明Hs_mrp2可能編碼一個新型的Group2型Mrp系統(tǒng)。
　　為了證明Hs_Mrp2系統(tǒng)具有Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運活性

7、。我們利用熒光猝滅法測定大腸桿菌(E.coli) KNabc/pUC-mrp2的反轉(zhuǎn)膜（KNabc/pUC18為負對照）單價陽離子/氫離子逆向轉(zhuǎn)運蛋白活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于負對照，KNabc/pUC-mrp2制備的反轉(zhuǎn)膜特別是在pH9.0～9.5均具有Na+(Li+，K+)/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白活性。
　　為了進一步分析NEAU-ST10-39T中Hs_mrp2的耐鹽堿能力，我們借助基因敲除質(zhì)粒pK18mobsacB構(gòu)建了帶有Hs_m

8、rp2同源臂的重組質(zhì)粒pK18-mrp2-NcoI，利用同源重組技術(shù)敲除宿主菌NEAU-ST10-39T中該Group2型Mrp基因，通過對原宿主NEAU-ST10-39T和敲除菌株進行生理生化分析的結(jié)果，以證明本實驗中所發(fā)現(xiàn)的Group2型Mrp的基因?qū)χ卸仁塞}菌NEAU-ST10-39T在耐鹽堿方面確實起到一定的作用。
　　基于以上結(jié)果，我們認為Hs_Mrp2為一個對宿主NEAU-ST10-39T在鹽堿性方面起主要作用的新型的