透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌溶血素-S基因缺失突變菌株的構(gòu)建及其特性研究.pdf

1、存在于生物機(jī)體各個(gè)組織器官中的透明質(zhì)酸是一種酸性黏多糖。由于該物質(zhì)具有優(yōu)良粘彈性和高度水合性的理化性質(zhì)，從而能越來越廣泛的應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、研究醫(yī)學(xué)、化妝品及食品藥品添加劑等相關(guān)領(lǐng)域，因此，在科學(xué)研究上具有極大價(jià)值。在工業(yè)生產(chǎn)上，馬鏈球菌獸疫亞種是發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的重要菌種之一。但由于該菌有一定的致病性，長期以來，人們擔(dān)心利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)得到透明質(zhì)酸產(chǎn)品的安全能否有保證。特別是該菌株所產(chǎn)生毒力因子——溶血素-S(SLS)能夠造成典型的細(xì)

2、胞溶血和細(xì)胞膜損壞。因此，我們要求發(fā)酵法獲得的透明質(zhì)酸中不能含有鏈球菌SLS毒素。研究發(fā)現(xiàn)，在化膿性鏈球菌中溶血素-S的基因sagA是一調(diào)控基因，能夠調(diào)控透明質(zhì)酸及毒力因子的表達(dá)。我們推測在sagA基因結(jié)構(gòu)相似的馬鏈球菌獸疫亞種中，sagA基因同樣能夠調(diào)控透明質(zhì)酸及毒力因子的表達(dá)。
　　本論文通過采用溫度敏感自殺載體系統(tǒng)和電轉(zhuǎn)化的方法構(gòu)建了馬鏈球菌獸疫亞種sagA基因缺失突變菌株和其回復(fù)突變菌株，使得HA生產(chǎn)菌不產(chǎn)溶血素-S。同時(shí)

3、利用不同的方法對(duì)馬鏈球菌獸疫亞種相關(guān)毒力因子進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于野生菌來說，sagA基因缺失突變菌中HA產(chǎn)量提高了30％、分子量下降了一個(gè)數(shù)量級(jí)。另外，與毒力相關(guān)的甘油醛-3-磷酸脫氫酶、Hylc、菌體表面蛋白含量顯著降低，透明質(zhì)酸分解酶含量增加。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌體的總毒力明顯下降。利用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步使透明質(zhì)酸產(chǎn)量提高了20％左右。
　　本研究證明，在馬鏈球菌獸疫亞種中sagA基因不僅表達(dá)溶血素-S，同時(shí)對(duì)