白地霉脂肪酶的制備、修飾改良及應(yīng)用研究.pdf

1、脂肪酶催化是綠色催化的重要組成部分。在非水相介質(zhì)中，脂肪酶催化活力不高是制約脂肪酶非水相催化的主要因素。運用定向進化和理化技術(shù)對脂肪酶進行修飾改良，創(chuàng)制出高酶活力和高穩(wěn)定性的酶制劑，是蛋白質(zhì)工程和酶催化劑工程領(lǐng)域的重要研究方向。圍繞脂肪酶修飾改良這一熱點問題，本文立足于脂肪酶畢赤酵母重組工程菌的構(gòu)建，以生產(chǎn)背景清晰的白地霉脂肪酶。分別以油酸甲酯合成和魚油水解代表非水相催化和水相催化，運用基于雙分子印跡的多重組合修飾、有機溶劑處理、交聯(lián)聚

2、集和酶蛋白包衣的新型固定化技術(shù)，對白地霉脂肪酶進行修飾改良，擬創(chuàng)制出適用于酯化合成和油脂水解的新型催化劑。本研究開發(fā)的雙分子印跡技術(shù)及其多重修飾技術(shù)，豐富了物理化學(xué)修飾技術(shù)；并將兩相固定化—魚油處理、交聯(lián)聚集和酶蛋白包衣修飾技術(shù)應(yīng)用于水解魚油富集PUFAs研究。創(chuàng)制出的修飾改良型白地霉脂肪酶水解魚油富集PUFAs效果明顯提高。這些非水相修飾和水相修飾方法還為其它酶的修飾改良提供了借鑒，可嘗試性地將粗放型的酶液創(chuàng)制成高活力和高操作穩(wěn)定性的

3、精細型酶制劑。主要結(jié)果及創(chuàng)新點摘要如下：
　　 1.構(gòu)建了白地霉脂肪酶基因工程菌，生產(chǎn)背景清晰的脂肪酶，代替高成本且背景不清晰的商品酶，提供用于修飾改良的酶源。在碩士階段構(gòu)建重組工程菌的基礎(chǔ)上，進一步比較了由四種載體pPIC9K、pPICZαA、pGAPZαA和GAP-pPIC9K構(gòu)建的重組菌的產(chǎn)酶效果，以pPIC9K載體構(gòu)建的重組菌酶活力最高。該重組脂肪酶對具有C9位順式雙鍵的長鏈不飽和脂肪酸甘油酯具有明顯的底物特異性，且具有

4、寬廣的天然油脂底物譜；對正己烷等有機溶劑具耐受性；其最適溫度范圍和最適pH分別為40-50℃和8.0。獨特的底物特異性和良好的有機溶劑、溫度及pH耐受性表明該酶擁有良好工業(yè)應(yīng)用潛力。
　　 2.綜合運用基于生物印跡的多重組合修飾技術(shù)，有效提高了脂肪酶的非水相催化活力和操作穩(wěn)定性。以油酸甲酯合成為模式反應(yīng)，以自制脂肪酶為研究材料，基于油酸和甲醇雙分子生物印跡，聯(lián)用pH記憶、添加劑激活、脂包衣及大孔樹脂固定化等物理化學(xué)修飾技術(shù)進行酶

5、的修飾改良。與未修飾酶相比，這些方法協(xié)同修飾使脂肪酶的酯化活力提高至18.4倍，重復(fù)使用10個批次仍能保留90％的相對轉(zhuǎn)化率。
　　 3.在常規(guī)大孔樹脂固定化的基礎(chǔ)上，引入了固定化前有機溶劑預(yù)處理和固定化后有機溶劑后處理；同時對脂肪酶進行了交聯(lián)聚集和酶蛋白包衣固定化修飾，提高了脂肪酶的非水相催化活力和操作穩(wěn)定性。先水相固定化，再用異丙醇處理，使脂肪酶的酯化活力提高至12.6倍；辛烷—水預(yù)處理，然后再固定化 (即兩相固定化) 使酯

6、化活力提高至14.8倍；交聯(lián)聚集制備的修飾酶PEI-CLEAs使酯化活力提高至16.1倍；酶蛋白包衣修飾制備的微晶酶PCMCs使酯化活力提高至19.7倍。四種新型固定化酶重復(fù)使用5個批次仍能保留80％以上的相對轉(zhuǎn)化率。
　　 4.在非水相修飾的基礎(chǔ)上，針對魚油水解的水相催化，調(diào)整修飾策略，用魚油處理代替油酸印跡，并偶聯(lián)辛烷—水兩相固定化修飾，應(yīng)用于魚油水解的水相催化，取得了良好效果。游離酶僅能達到12％的水解度，水相固定化修飾酶

7、能將其提高至28％，兩相固定化修飾酶可提高至31％，水相固定化與魚油處理組合修飾酶可提高至36％，而兩相固定化與魚油處理組合修飾酶則可提高至40％。固定化—魚油處理酶的酶促反應(yīng)初速度和水解度高于固定化—油酸印跡酶，而魚油處理和固定化分步與同步制備對酶促反應(yīng)的初速度和水解度影響不大。強極性和非極性溶劑均弱化了固定化—魚油處理酶的催化活力，弱極性溶劑則能維持較好的催化效果。重復(fù)使用5個批次后，固定化—魚油處理酶仍能保留80％的水解度。辛烷—

8、水兩相固定化與魚油處理組合修飾用于魚油水解反應(yīng)系本文首創(chuàng)。
　　 5. 將交聯(lián)聚集修飾應(yīng)用于魚油水解的水相催化，PEI-CLEAs水解魚油的初速度、水解度、操作穩(wěn)定性、溫度和有機溶劑耐受性均優(yōu)于游離酶。PEI-CLEAs能獲得42％的水解度，將EPA和DHA從原始魚油的6.94％和0.97％分別富集到12.69％和3.88％，EPA和DHA (EPA+DHA) 得率為77.51％。PEI-CLEAs在50-55 ℃仍能保留65％

9、的相對水解度，經(jīng)丙酮、叔丁醇和辛烷處理后仍能保留85％的相對水解度。重復(fù)使用5個批次，PEI-CLEAs相對水解度能保持72％。
　　 6. 將酶蛋白包衣修飾應(yīng)用于魚油水解的水相催化，PCMCs水解魚油的初速度、水解度、操作穩(wěn)定性、溫度和有機溶劑耐受性也均優(yōu)于游離酶。PCMCs能獲得48％的水解度，將EPA和DHA分別富集到12.89％和3.98％，EPA和DHA得率為81.04％。PCMCs在45-50℃范圍內(nèi)能保持85％以上