苯甲酸鈉與糖精鈉、檸檬黃體外聯(lián)合毒性的研究.pdf

1、目的：采用L929和PC12細胞株，以通常在食品中同時存在的苯甲酸鈉、糖精鈉和檸檬黃為受試物，進行單獨和聯(lián)合作用對體外細胞的直接毒性、DNA損傷和神經(jīng)突生長抑制的研究，初步探索多種食品添加劑同時使用的安全性。
　　 方法：(1)采用MTT試驗方法及效應(yīng)相加模型聯(lián)合染毒方案檢測受試物對細胞增殖的毒性作用；(2)采用乳酸脫氫酶試劑盒及2×2析因設(shè)計方差分析檢測受試物對細胞上清液乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響；(3)采用ELISA試劑

2、盒及2×2析因設(shè)計方差分析檢測受試物對細胞中8-OHdG含量的影響；(4)采用單細胞凝膠電泳(SCGE)及2×3析因設(shè)計方差分析檢測細胞DNA斷裂損傷；(5)采用KCl-SDS沉淀法及2×2析因設(shè)計方差分析檢測受試物對細胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)效應(yīng)(DPC)；(6)采用神經(jīng)突長度測量法及效應(yīng)相加模型設(shè)計檢測受試物對PC12細胞的神經(jīng)突生長抑制效應(yīng)。
　　 結(jié)果：(1)細胞直接毒性。各受試物單獨對L929細胞增殖均有抑制作用，并存在劑

3、量—效應(yīng)應(yīng)關(guān)系。其中苯甲酸鈉、糖精鈉和檸檬黃的IC50分別為6.47±0.07，19.50±0.37和33.09±0.81g/L。苯甲酸鈉+糖精鈉、苯甲酸鈉+檸檬黃對細胞增殖的抑制效應(yīng)為相加作用(P＞0.05)。苯甲酸鈉(6，10g/L)、糖精鈉(6，20，34g/L)和檸檬黃(34，58g/L)引起細胞培養(yǎng)上清液的LDH活性明顯升高(P＜0.05)，并有劑量—效應(yīng)應(yīng)關(guān)系。苯甲酸鈉+糖精鈉、苯甲酸鈉+檸檬黃對培養(yǎng)細胞上清液LDH活性影響

4、為相加作用(P＞0.05)。(2)DNA損傷。除了檸檬黃在12.00g/L引起細胞內(nèi)8-OHdG含量較空白對照組增加(P＜0.05)，三種受試物各劑量組單獨，以及苯甲酸鈉+糖精鈉、苯甲酸鈉+檸檬黃對L929細胞內(nèi)8-OHdG含量沒有影響(P＞0.05)。在SCGE試驗中，苯甲酸鈉、糖精鈉和檸檬黃單獨作用都引起L929細胞DNA斷裂損傷，表現(xiàn)為細胞DNA拖尾的數(shù)量、DNA尾長、尾/頭長比、尾％DNA較空白對照組顯著增加(P＜0.01)，并

5、有劑量——反應(yīng)關(guān)系。檸檬黃、苯甲酸鈉和糖精鈉在DNA損傷強度上，引起細胞DNA拖尾率顯著增加的最低劑量分別為0.06，0.50和5g/L。苯甲酸鈉+糖精鈉對細胞DNA斷裂損傷的各項指標的影響沒有協(xié)同作用(P＞0.05)，而苯甲酸鈉+檸檬黃對反映細胞DNA斷裂損傷的各項指標影響表現(xiàn)為拮抗作用(P＜0.05)。苯甲酸鈉、糖精鈉、檸檬黃分別從3，20和58g/L的劑量開始引起L929細胞DPC系數(shù)顯著增高(P＜0.01)。苯甲酸鈉+糖精鈉對D

6、PC系數(shù)影響表現(xiàn)為相加作用(P＞0.05)，而苯甲酸鈉+檸檬黃表現(xiàn)為協(xié)同作用(P＜0.05)。(3)神經(jīng)突生長抑制。檸檬黃、糖精鈉和苯甲酸鈉對PC12細胞神經(jīng)突生長的IC50分別為0.96±0.25，3.20±1.30和4.27±0.46g/L，抑制作用有明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。苯甲酸鈉+糖精鈉對PC12細胞神經(jīng)突生長抑制作用為相加作用(P＞0.05)；苯甲酸鈉+檸檬黃在兩者50％IC20-25的劑量聯(lián)合作用時對PC12細胞神經(jīng)突生長抑制

7、率為44.56±0.90％，與真實期望抑制率(25.55±2.51％)比較差別有顯著性(P＜0.05)，表現(xiàn)為協(xié)同作用。
　　 結(jié)論：苯甲酸鈉、糖精鈉和檸檬黃能抑制細胞增殖、使細胞培養(yǎng)上清液中LDH活性增加，表明受試物有細胞膜直接毒性，可能通過改變細胞膜結(jié)構(gòu)完整性和通透性而影響細胞成活與增殖。苯甲酸鈉+糖精鈉、苯甲酸鈉+檸檬黃對細胞增殖抑制和對細胞培養(yǎng)上清液中LDH活性改變均無協(xié)同作用。三種受試物能抑制PC12細胞神經(jīng)突生長，以

8、檸檬黃的作用最強。苯甲酸鈉+糖精鈉對PC12細胞神經(jīng)突生長抑制沒有協(xié)同作用，而苯甲酸鈉+檸檬黃則具有協(xié)同作用。這種效應(yīng)可能與某些食品添加劑影響兒童的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和改變行為有關(guān)。三種受試物單獨及聯(lián)合作用雖有沒有氧化性損傷作用，但都能引起DNA的斷裂損傷和DPC增加。苯甲酸鈉+檸檬黃對細胞DNA斷裂損傷沒有協(xié)同作用，苯甲酸鈉+檸檬黃對DNA斷裂損傷表現(xiàn)為拮抗作用，可能與DPC形成掩蓋了DNA斷裂損害的表現(xiàn)有關(guān)。在DPC效應(yīng)上，苯甲酸鈉+糖精