基因工程與基因組重排技術(shù)構(gòu)建釀酒酵母高效木糖發(fā)酵菌株及甘油發(fā)酵菌株.pdf

1、由于二氧化碳排放引起的氣候變化和化石燃料日益枯竭,人類已經(jīng)投入越來越多的精力于尋找替代能源。生物乙醇作為一種無污染的可再生能源,是極具前途的燃料替代品之一。利用糧食發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的傳統(tǒng)方法會(huì)造成糧食短缺,將生物柴油生產(chǎn)中的主要副產(chǎn)物甘油和工農(nóng)業(yè)殘余物中大量富含木糖的木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn),對(duì)于解決環(huán)境以及能源問題有著重要的意義。
　　本實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母saccharomyces cerevisiae工業(yè)菌株為出發(fā)菌進(jìn)行

2、了甘油利用及木糖代謝方面的研究。首先,我們在缺失甘油生成途徑的LGE73菌株中整合編碼NADH氧化酶的noxE基因調(diào)節(jié)細(xì)胞還原力,染色體重組過表達(dá)編碼磷酸二羥丙酮激酶的DAK1、DAK2基因和甘油脫氫酶的GCY1基因。YPG平板培養(yǎng)顯示noxE基因的整合對(duì)LGE73在甘油培養(yǎng)基中的生長有促進(jìn)作用。RT-PCR測定顯示DAK1,DAK2,GCY1的轉(zhuǎn)錄水平都得到了顯著增強(qiáng),但仍處于較低水平。甘油培養(yǎng)基中發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明,改造菌株需要經(jīng)過長達(dá)1

3、44h的發(fā)酵才能利用16g/l的甘油,乙醇產(chǎn)量也只有0.6g/l。
　　我們在實(shí)驗(yàn)室已有木糖利用菌株KAM-6X中缺失了編碼對(duì)硝基苯磷酸酶的PHO13基因,獲得菌株KAM-6X(△PHO13),PHO13的缺失對(duì)木糖利用表現(xiàn)出積極作用,缺失菌株最大比生長速率為0.261h-1,可在48h耗掉50g/l的木糖,糖醇轉(zhuǎn)化率增加到0.313g/g,木糖醇和甘油產(chǎn)量降低,而乙酸產(chǎn)量增加。我們還將新的有性重組介導(dǎo)的基因組重排方法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室

4、原有木糖利用菌株KAM-6X(K270R)中,先將其轉(zhuǎn)化為二倍體細(xì)胞,缺失編碼α交配因子受體的STE2基因,進(jìn)行EMS誘變、有性重組及進(jìn)化工程篩選,獲得木糖代謝能力顯著增強(qiáng)的菌株WCY1。WCY1可在48h內(nèi)消耗100g/l的木糖并達(dá)到0.395g/g的乙醇產(chǎn)率,最大比生長速率可達(dá)0.294h-1,這在現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的木糖發(fā)酵釀酒酵母菌株中位居前列。對(duì)WCY1進(jìn)行混合糖發(fā)酵,顯示木糖利用還是被葡萄糖抑制。測定木糖利用酶的酶活表明篩選獲得了