利用纖維素發(fā)酵的釀酒酵母工程菌株的構(gòu)建及其初步評(píng)價(jià).pdf

1、纖維素是自然界中分布最廣、含量最豐富的一種多糖。能源危機(jī)、環(huán)境污染和糧食短缺,使得越來(lái)越多的國(guó)家開(kāi)始選擇使用纖維素為原料來(lái)生產(chǎn)乙醇。水解纖維素的酶系包括內(nèi)切酶(EG)、外切酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BGL),它們?nèi)齻€(gè)的共同作用可以將纖維素水解為單糖,而后能被釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)醇。本課題采用δ-整合的方法在釀酒酵母中表達(dá)這三種纖維素酶,從而構(gòu)建能利用纖維素產(chǎn)醇的釀酒酵母工程菌株。
　　本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建了棘孢曲霉(Aspergillus

2、 aculeatus)β-葡萄糖苷酶bgl1基因表達(dá)盒Ptpi-xyn2s-ABGL1-Tadh I和瑞氏木霉(Trichoderma reesei)內(nèi)切酶egl2基因表達(dá)盒Ptpi-xyn2s-TEGII-Tadh I。因此本研究首先分離、克隆了全長(zhǎng)的棘孢曲霉外切酶基因cbh1,測(cè)序后經(jīng)比對(duì)首次鑒定出其有1個(gè)內(nèi)含子,2個(gè)外顯子,以此為基礎(chǔ),成功構(gòu)建了棘孢曲霉外切酶基因表達(dá)盒Ptpi-xyn2s-ACBHI-Tadh I。同時(shí)還構(gòu)建了瑞

3、氏木霉外切酶基因cbh1基因表達(dá)盒Ptpi-xyn2s-TCBHI-Tadh I和瑞氏木霉外切酶基因cbh2基因表達(dá)盒Ptpi-xyn2s-TCBHII-Tadh I。
　　為將以上基因表達(dá)盒高拷貝整合至釀酒酵母染色體,本文構(gòu)建了含LEU2、HIS3、TRP1和URA34種不同篩選標(biāo)記的δ-整合平臺(tái),以棘孢曲霉bgl1和瑞氏木霉egl2為目的基因,評(píng)價(jià)了δ-整合平臺(tái)中不同篩選標(biāo)記對(duì)外源基因表達(dá)的影響。第5天的BGL和EG酶活(U/

4、ml)結(jié)果表明:篩選標(biāo)記影響纖維素酶基因的表達(dá),LEU2使外源基因表達(dá)最高(2.97/29.01),其次是HIS3(2.29/12.41)和TRP1(1.78/8.12),而URA3最低(1.52/1.48);各菌株5天內(nèi)的比酶活(U/ml/OD660)基本為一定值,分別在0.193~0.207/1.9~2.1、0.087~0.093/0.87~0.95、0.067~0.073/0.5~0.54和0.028~0.032/0.09~0.1

5、1范圍內(nèi)。
　　將5個(gè)δ-整合質(zhì)粒(pGEM-T easy-δseq-TRP1-TEGII、pGEM-T easy-δseq-HIS3-ABGL1、pGEM-T easy-δseq-LEU2-ACBHI、pGEM-T easy-δseq-LEU2-TCBHI和pGEM-T easy-δseq-LEU2-TCBHII)分三輪轉(zhuǎn)入釀酒酵母染色體中,篩選重組子,并進(jìn)行PCR鑒定、酶活分析以及纖維素發(fā)酵評(píng)價(jià)等,結(jié)果表明:纖維素內(nèi)切酶、外切