納豆激酶的分離純化和酶學性質(zhì)的研究.pdf

1、為了獲得高純度、高比活的納豆激酶產(chǎn)品。我們以生產(chǎn)納豆激酶的Bacillus subtilis進行深層發(fā)酵得到的發(fā)酵液為原料,離心去除菌體,進行分離純化。采用兩種方法,第一種方法:20％-60%飽和度硫酸銨沉淀,Superdex75凝膠過濾層析和SP SepharoseFast Flow離子交換層析對活性組分進行分離提純,用纖維平版法測定活力,SDS-PAGE對分離純化的效果進行了檢驗,只觀察到單一條帶,最終純化倍數(shù)和酶活回收率分別為8.

2、4和49%。第二種方法:將發(fā)酵液裝入截留分子量為6,000的透析袋中,置于純水中透析24小時。透析后的酶活回收率為83.8%,純化倍數(shù)為1.05。將透析后的發(fā)酵液上SP Sepharose Fast Flow離子交換柱進行梯度洗脫,流速為5mL/min,上樣量為15mL,最終的純化倍數(shù)為2.4,酶活回收率為71%。所得到的納豆激酶有雜蛋白?？疾旒兤芳{豆激酶的酶學性質(zhì)得到以下結果,納豆激酶作用于纖維蛋白的最適溫度為55℃左右,最適pH為9

3、.4左右。納豆激酶在pH6-12的范圍內(nèi)穩(wěn)定。納豆激酶在37℃以下,5小時失活并不明顯,45℃下略有失活,而當溫度達到50℃后酶活下降很快。NK酶液在4℃下放置一周酶活僅僅損失16%,室溫下放置一周酶活損失37%,37℃下放置18hr酶活仍保有85%,放置2天仍在50%以上。0.1mM PMSF可以完全抑制納豆激酶活力,EDTA不抑制納豆激酶活力,DTT對納豆激酶的活性沒有影響,1mM低濃度的SDS不抑制納豆激酶活性,10mM SDS略

4、有抑制作用。Mg2+對納豆激酶有微弱的激活作用;Ca2+、Ba2+的影響不大;其它一些金屬離子存在不同程度的抑制作用,Cu2+的抑制作用最明顯,Al3+、K+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ni2+、Cr3+、Pb2+、Ag+也有不同程度的抑制作用。脫脂乳粉、明膠、海藻酸鈉、殼聚糖、BSA、淀粉、甘油、糊精、甘露醇都有在高溫環(huán)境下穩(wěn)定NK的作用。納豆激酶的溶栓方式不同于尿激酶,既有直接作用方式,又有間接作用方式,直接

5、纖溶活性占總活性的78%左右。納豆激酶降解纖維蛋白不同肽鏈的速度不等,γ-γ二聚體的降解速度快于α鏈,而α鏈又要快于β鏈和γ鏈。為了使納豆激酶在腸道中得到吸收,本文對納豆激酶的腸溶藥物進行了初步研究,分別以海藻酸鈣和CAP(鄰苯二甲酸醋酸纖維素酯)為包衣材料,得到以下結果:海藻酸鈣納豆激酶腸溶膠囊在模擬胃液中,2h內(nèi)的釋放度為8.1%。在模擬腸液中,2h后的釋放量為82.6%。但前1h內(nèi)的釋放量只有14.8%,回收率為75.8%。以CA