腫瘤細(xì)胞及端粒酶檢測(cè)的生物傳感技術(shù)新方法的研究.pdf

1、各種疾病已經(jīng)嚴(yán)重威脅到了人類的健康，而隨著人類生存環(huán)境的惡化，腫瘤更是目前奪取人們性命的一大殺手。腫瘤的發(fā)生嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量，危及著人們的生命安全，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)，對(duì)于疾病的確診與治療具有非常重要的意義。端粒酶則是各種惡性腫瘤細(xì)胞一個(gè)共同的分子標(biāo)志物，對(duì)端粒酶活性的檢測(cè)于癌癥的早期發(fā)現(xiàn)、發(fā)展和預(yù)后都有重大意義。本論文結(jié)合了近年來(lái)出現(xiàn)的一些新的傳感識(shí)別元件，利用電化學(xué)、光化學(xué)檢測(cè)方法研究了對(duì)腫瘤細(xì)胞及端粒酶活性

2、的檢測(cè)。
　　1.本章我們利用細(xì)胞核酸適體以及生物催化銀沉積信號(hào)放大方法建立了一種檢測(cè)腫瘤細(xì)胞-人B淋巴細(xì)胞瘤(Ramos細(xì)胞)的電化生物傳感器。首先我們利用巰基修飾的細(xì)胞核酸適體在金電極上捕獲細(xì)胞，通過(guò)Ramos細(xì)胞與另一條生物素標(biāo)記的核酸適體的特異性結(jié)合作用，形成了核酸適體-細(xì)胞-核酸適體的夾心復(fù)合物。然后通過(guò)核酸適體上標(biāo)記的生物素與鏈酶親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(ALP)作用，ALP催化抗壞血酸磷酸脂形成的抗壞血酸還原Ag+成金

3、屬單質(zhì)Ag沉積在電極表面，采用線性掃描伏安法(LSV)檢測(cè)Ag的電化學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)Ramos細(xì)胞的放大檢測(cè)。結(jié)果表明，檢測(cè)Ramos細(xì)胞的線性關(guān)系范圍是10-106cells，檢測(cè)到的細(xì)胞最小濃度為10 cells，說(shuō)明其具有很好的檢測(cè)靈度。該方法低的檢測(cè)限歸結(jié)于生物催化銀沉積的放大作用。
　　2.本章是基于端粒酶擴(kuò)增反應(yīng)以及目標(biāo)物誘導(dǎo)DNA鏈結(jié)構(gòu)變換的方法建立的一種用于檢測(cè)端粒酶活性的電化學(xué)生物傳感器。巰基修飾的端粒酶(TS)引

4、物鏈組裝在金電極上，二茂鐵標(biāo)記的短鏈DNA與之雜交，由于二茂鐵接近電極表面而發(fā)生高效的電子傳遞。在端粒酶和混合核苷酸(dNTPs)的存在下，TS引物鏈開(kāi)始擴(kuò)增重復(fù)序列TTAGGG，而擴(kuò)增的重復(fù)序列與雜交區(qū)域的堿基互補(bǔ)，可以雜交形成雙鏈，致使折疊成“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)，二茂鐵標(biāo)記的DNA短鏈則從電極表面釋放下來(lái)，氧化還原峰電流信號(hào)減小。通過(guò)氧化還原峰電流信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)端粒酶活性的檢測(cè)。此方法的檢測(cè)范圍是100-60000cells，檢測(cè)到的細(xì)胞最小濃

5、度為100 cells。該方法對(duì)端粒酶活性的檢測(cè)具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單和背景信號(hào)低，不易出現(xiàn)假陰性結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)。
　　3.本章是基于端粒酶擴(kuò)增反應(yīng)，目標(biāo)物誘導(dǎo)DNA鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換以及納米金信號(hào)放大的方法建立了一種熒光生物傳感器用于端粒酶活性的檢測(cè)。巰基探針和熒光探針先退火雜交，然后將雜交雙鏈通標(biāo)記在納米金顆粒上，這樣拉近了納米金與熒光基團(tuán)FAM之間的距離，由于納米金的猝滅作用，致使FAM的熒光強(qiáng)度大大降低。在端粒酶和混合核苷酸(dNTP