甲基轉(zhuǎn)移酶、生物硫醇檢測(cè)新方法研究.pdf

1、DNA甲基化在人類(lèi)基因組中表觀遺傳修飾和在基因的調(diào)控中起重要作用。在異常的甲基化中，甲基轉(zhuǎn)移酶將S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基轉(zhuǎn)移到CpG島上胞嘧啶的C5位置上。CpG島中基因啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化是新一代癌癥生物標(biāo)志物，因此，對(duì)于快速檢測(cè)DNA甲基化和轉(zhuǎn)移酶活性可以為早期癌癥診斷提供一種有效的方法。然而，傳統(tǒng)分析檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶的方法具有耗時(shí)、費(fèi)用高以及靈敏度不高等缺點(diǎn)。所以，迫切需要發(fā)展新方法，實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)單、靈敏檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶活性，

2、同時(shí)檢測(cè)CpG島的甲基位點(diǎn)可以用于確定特定的癌癥類(lèi)型。為抗癌藥物發(fā)展和癌癥診斷提供了理論基礎(chǔ)。本文研究?jī)?nèi)容主要包括以下兩個(gè)方面：
　　（1）基于酶輔助雙信號(hào)放大的電化學(xué)方法高靈敏檢測(cè) Dam甲基轉(zhuǎn)移酶活性。首先，通過(guò)DNA雜交作用將二茂鐵-DNA（S2）組裝到巰基-DNA（S1）修飾電極表面，產(chǎn)生二茂鐵的良好電化學(xué)信號(hào)。Dam甲基轉(zhuǎn)移酶能將S-腺苷甲硫氨酸（SAM）上的甲基轉(zhuǎn)移到發(fā)夾DNA的腺嘌呤的N6位置上，進(jìn)而限制性內(nèi)切酶Dp

3、n I將發(fā)生甲基化的發(fā)夾DNA在甲基化位點(diǎn)剪切，釋放出單鏈DNA（S3）。將制備的巰基-DNA（S1）和二茂鐵-DNA（S2）修飾金電極探針浸泡在以上溶液中，釋放出的S3與修飾金電極雙鏈探針中的S2凸出的部分雜交形成新的雙鏈DNA。經(jīng)核酸外切酶III作用，能夠從新形成的雙鏈DNA的S2的3′端進(jìn)行剪切，導(dǎo)致二茂鐵脫離電極表面。釋放出的S3繼續(xù)與修飾金電極雙鏈探針中的S2凸出的部分雜交形成新的雙鏈DNA而進(jìn)入下一個(gè)剪切放大循環(huán)，多次循環(huán)，

4、使得S2標(biāo)記的二茂鐵大量脫離電極表面導(dǎo)致二茂鐵的電流強(qiáng)度下降，同時(shí)電極表面的大量巰基化單鏈S1被釋放出來(lái)，將電極浸泡在含有血紅素和鉀離子的溶液中，形成的G-四鏈體-血紅素復(fù)合物。電化學(xué)測(cè)量結(jié)果表明，由于二茂鐵脫離電極表面而電流降低，電極表面的單鏈 S1與血紅素形成G-四鏈體-血紅素復(fù)合物而電流增強(qiáng)，通過(guò)二者電流強(qiáng)度之比即可實(shí)現(xiàn)Dam甲基轉(zhuǎn)移酶的靈敏檢測(cè)。本方法的優(yōu)點(diǎn)如下：(1)對(duì)Dam甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)限能夠達(dá)到4.8×10-3 U mL

5、-1，靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他檢測(cè)方法；(2)對(duì)Dam甲基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別的特異性強(qiáng)，其他的甲基轉(zhuǎn)移酶，如M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶，不干擾測(cè)定，所以，本方法的選擇性高；(3)可用于Dam甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的篩選，結(jié)果表明絲裂霉素、順氯氨鉑對(duì)Dam甲基轉(zhuǎn)移酶沒(méi)有影響，而青霉素和5-氟尿嘧啶對(duì)Dam甲基轉(zhuǎn)移酶的活性有明顯抑制效果，其中5-氟尿嘧啶對(duì)Dam甲基轉(zhuǎn)移酶抑制效果最強(qiáng)。
　?。?）建立了一種基于 SAM和金納米粒子的生物硫醇免標(biāo)記比色檢測(cè)法。

6、SAM包含一個(gè)高能的手性硫離子，該硫離子分別與甲基、無(wú)碳糖、以及甲硫氨酸連接。硫帶有孤對(duì)電子，五碳糖上含有一個(gè)高電負(fù)性的氧，能夠使硫原子的孤對(duì)電子轉(zhuǎn)移到氧原子上，從而使得SAM分子帶正電；而檸檬酸三鈉還原合成的金納米粒子表面帶負(fù)電。當(dāng) SAM與金納米粒子混合，SAM可以中和金納米粒子表面的電荷，導(dǎo)致金納米粒子之間的排斥力減小，從而使得金納米粒子發(fā)生團(tuán)聚，金納米粒子溶液的顏色由紅色變成藍(lán)色。由于生物硫醇含巰基官能團(tuán)，能夠通過(guò)金硫鍵作用阻礙

7、SAM誘導(dǎo)金納米粒子的團(tuán)聚，因此當(dāng)生物硫醇存在時(shí)，金納米粒子溶液顏色不變。據(jù)此，建立了生物硫醇的比色檢測(cè)方法。此外，在檢測(cè)生物硫醇的過(guò)程中，金納米粒子溶液顏色的變化還能夠通過(guò)裸眼觀察到，因此可以實(shí)現(xiàn)生物硫醇的可視化檢測(cè)。在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，半胱氨酸、谷胱甘肽和高半胱氨酸檢測(cè)的線性范圍分別為0.4-1.2μM、0.2-0.9μM和0.6-3.0μM；檢測(cè)限分別為35.8 nM、21.7 nM和62.4 nM。與其他比色法相比，本方法的靈敏