殼聚糖-超氧化物歧化酶結(jié)合物(O-HTCC-SOD)的制備及其對輻射損傷的防治作用研究.pdf

1、電離輻射指能使物質(zhì)發(fā)生電離現(xiàn)象的輻射，如α粒子、β粒子、X射線以及γ射線等。目前電離輻射已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于核能發(fā)電、疾病治療和診斷、農(nóng)作物育種、金屬勘探和科學(xué)研究等領(lǐng)域。其在造福人類的同時，也使人類接觸輻射的機(jī)會大大增加，嚴(yán)重威脅著人們的健康，甚至生命。輻射損傷的機(jī)制極其復(fù)雜，其中輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是誘發(fā)輻射損傷的主要機(jī)制。因此，生物體內(nèi)最重要的ROS高效清除劑——超氧化物

2、歧化酶(superoxide dismutase，SOD)被公認(rèn)為是最理想的輻射防治藥物。但是，天然SOD存在穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短、細(xì)胞親和力差和異源酶容易引起免疫反應(yīng)等缺陷，限制了它的臨床應(yīng)用。因此，本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，首次利用一種新型的6-O-季銨化殼聚糖衍生物——6．O-2’-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖(6-O-2’-hydroxylpropyltrimethyl ammonium chloride chitosan,O-H

3、TCC)對SOD的末端羧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，并經(jīng)一步純化制備了O-HTCC-SOD;采用SDS-PAGE、SEC-HPLC、圓二色譜、粒徑/電位分析和電鏡掃描等對O-HTCC-SOD的主要理化性質(zhì)進(jìn)行了分析;鄰苯三酚比色法測定了pH值、溫度及蛋白水解酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）對O-HTCC-SOD酶活性的影響，以及α淀粉酶降解O-HTCC對O-HTCC-SOD酶活性的影響;然后應(yīng)用優(yōu)化的MTT法體外評價了O-HTCC-SOD對小鼠肺成纖維細(xì)胞

4、L929和胚胎成纖維細(xì)胞3T3的輻射防護(hù)作用;采用總SOD測試盒檢測尾靜脈給藥后小鼠外周血和肝、腎組織中O-HTCC-SOD的活性，并通過DAS2.0軟件計算其基本藥代動力學(xué)參數(shù);參考抗輻射藥物的臨床前試驗指導(dǎo)原則，完成了O-HTCC-SOD對小鼠輻射損傷防護(hù)作用的評價。本論文的取得的研究成果如下:
　　1.6-O-季銨化殼聚糖衍生物O-HTCC的制備
　　通過三步化學(xué)反應(yīng)將季銨基團(tuán)側(cè)鏈接枝到C6位的羥基上，并經(jīng)一步超濾純化

5、得到水溶性好的季銨化殼聚糖衍生物O-HTCC，產(chǎn)率為92.0％。IR和1H NMR分析表明O-HTCC結(jié)構(gòu)與預(yù)期相符，茚三酮比色法測定O-HTCC的自由氨基率為73.35％。O-HTCC兼具水溶性好和自由氨基含量高的優(yōu)點，更適合用于后續(xù)的SOD結(jié)構(gòu)修飾。
　　2.O-HTCC-SOD的制備、分離純化和性質(zhì)分析
　　以EDC/NHS作為偶聯(lián)劑，經(jīng)SOD的羧基活化和與O-HTCC形成酰胺鍵兩步反應(yīng)實現(xiàn)對SOD的末端羧基的結(jié)構(gòu)修飾

6、，修飾率超過90％。經(jīng)DEAE SepharoseFast Flow陰離子交換樹脂分離純化，最終得到O-HTCC-SOD精品。SDS-PAGE和SEC-HPLC分析表明O-HTCC-SOD分子量明顯大于天然SOD且呈寬的連續(xù)分布;圓二色譜分析表明O-HTCC-SOD二級結(jié)構(gòu)中的優(yōu)勢構(gòu)象變化較小，空間排列比SOD更加規(guī)則、有序;粒徑分布和電鏡掃描分析表明O-HTCC-SOD保持SOD的球狀結(jié)構(gòu)，但粒徑顯著大于SOD;電位分析表明O-HTC

7、C-SOD帶較多的正電荷。
　　3.O-HTCC-SOD的酶學(xué)性質(zhì)研究
　　采用鄰苯三酚法測定了O-HTCC-SOD在不同pH、溫度以及含胃蛋白酶、胰蛋白酶的條件下的酶活變化，結(jié)果顯示:在pH為3或11時，O-HTCC-SOD的酶活保留率顯著高于天然SOD;溫度穩(wěn)定性試驗表明O-HTCC-SOD在40℃～70℃的高溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定性優(yōu)于天然SOD;蛋白酶降解實驗中，在胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用下，天然SOD酶活保持率明顯下降，O

8、-HTCC-SOD活性基本穩(wěn)定或略微有所上升。因此，SOD被O-HTCC修飾后，所得結(jié)合物具有更寬的pH適應(yīng)范圍、更好的熱穩(wěn)定性和更強(qiáng)的抗蛋白酶降解能力，表明共價結(jié)合于SOD表面的高分子聚合物O-HTCC顯著提高了SOD的穩(wěn)定性。此外，在確定殼聚糖的衍生物O-HTCC具備生物可降解的基礎(chǔ)上，我們還證明:α淀粉酶具有持續(xù)提高O-HTCC-SOD酶活性的特點。推測可能是α淀粉酶緩慢水解了SOD結(jié)合物表面的O-HTCC，使原來被O-HTCC部

9、分封閉的SOD活性位點充分暴露，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的酶活性。因此，結(jié)合物具有α淀粉酶介導(dǎo)的酶活性緩釋特性。
　　4.O-HTCC-SOD的體外輻射保護(hù)作用評價
　　以L929細(xì)胞為研究對象，通過MTT實驗篩選合適的O-HTCC-SOD給藥劑量，并評價其對兩種細(xì)胞的輻射損傷保護(hù)作用。結(jié)果表明，L929細(xì)胞對O-HTCC-SOD的最大耐受劑量為250U/mL;O-HTCC-SOD對上述細(xì)胞系具有一定的保護(hù)作用;在一定時間內(nèi)，α-淀粉

10、酶通過緩慢降解O-HTCC-SOD中的O-HTCC使結(jié)合物表現(xiàn)出持續(xù)增強(qiáng)的細(xì)胞輻射保護(hù)作用。此外，初步研究發(fā)現(xiàn)O-HTCC-SOD可與L929細(xì)胞結(jié)合，入胞能力顯著增強(qiáng)。
　　5.O-HTCC-SOD在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)初步研究
　　采用總SOD檢測試劑盒對小鼠靜脈單次給藥的藥代動力學(xué)研究，結(jié)果表明，天然SOD體內(nèi)藥動學(xué)行為符合常規(guī)二室模型，而O-HTCC-SOD與常規(guī)的靜脈給藥模型不符，其濃度-時間曲線呈“幾”字形;O-

11、HTCC-SOD在體內(nèi)分布半衰期為1.25h，顯著長于天然SOD(0.25h);O-HTCC-SOD生物利用度較天然SOD也略有提高;通過對血藥濃度達(dá)峰時間(Tmax)以及最大血藥濃度的比較，初步確定結(jié)合物在體內(nèi)表現(xiàn)出一定的緩釋特性。肝臟中SOD以及O-HTCC-SOD濃度．時間變化曲線表明SOD在肝臟被迅速清除，O-HTCC-SOD則先在肝臟快速聚集，然后緩慢清除，提示O-HTCC-SOD表現(xiàn)出一定的肝靶向性。腎臟中SOD和O-HTC

12、C-SOD濃度．時間曲線差別較小，表明O-HTCC對SOD的修飾對該在腎臟的聚集和清除影響較小。
　　6.O-HTCC-SOD的體內(nèi)輻射保護(hù)作用評價
　　用BALB/c小鼠作為實驗對象，評價了高、中、低劑量O-HTCC-SOD對對8GyX射線照射誘導(dǎo)的急性輻射損傷防護(hù)作用。采用全自動血液分析儀對各組小鼠進(jìn)行外周血象分析，正常小鼠經(jīng)輻射照射后白細(xì)胞數(shù)迅速下降，同時紅細(xì)胞和血小板數(shù)變化較小，表明急性輻射損傷對與白細(xì)胞功能相關(guān)的免

13、疫系統(tǒng)等功能影響較大。高劑量O-HTCC-SOD組能夠使照射小鼠外周血白細(xì)胞恢復(fù)到正常水平，中、低劑量組及SOD組亦表現(xiàn)出顯著的輻射損傷防護(hù)作用(P＜0.05)。胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測定結(jié)果表明，輻射導(dǎo)致小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均明顯減小;高、中劑量結(jié)合物組與陰性組相比，胸腺指數(shù)和脾指數(shù)都顯著增大（高劑量組P＜0.01，中劑量組P＜0.05）;SOD陽性組和O-HTCC組對胸腺指數(shù)和脾指數(shù)保護(hù)作用不明顯。微量丙二醛(MDA)試劑盒測定肝臟、肺

14、MDA含量，結(jié)果表明，O-HTCC-SOD對肝臟和肺部因脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的MDA具有有效的清除作用，并呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，SOD的清除作用不明顯。對各組小鼠小腸、肝臟和肺組織制作病理切片并進(jìn)行HE染色，結(jié)果表明，O-HTCC-SOD對這三種器官均具有明顯的輻射損傷防護(hù)作用，并且具有濃度依賴性，SOD也沒有起到明顯的保護(hù)作用。因此，O-HTCC-SOD對X射線照射誘導(dǎo)的小鼠急性輻射損傷具有顯著的防護(hù)作用，并呈劑量依賴性。
　　總之