降血糖藥物普蘭林肽的固相合成.pdf

1、世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,全球糖尿病患者已超過3.6億人,我國糖尿病患者人數(shù)居世界第一,現(xiàn)有降糖藥物種類較多,降糖機制不盡相同,但是仍不能滿足臨床用藥的需要。2005年3月,FDA批準普蘭林肽(Pramlintide)注射劑用于成人1型和2型糖尿病,并取得良好的臨床效果。普蘭林肽是1型和2型糖尿病的輔助[1]治療藥物,主要用于單用某種降糖藥物不起作用的糖尿病患者,它輔助降糖藥物形成一種人體內環(huán)境,使其發(fā)揮降糖作用。此外,有研究報道,普蘭

2、林肽還具有調節(jié)食欲[2]的作用,美國Amylin制藥公司正在利用普蘭林肽開發(fā)減肥藥。國內報道,黃亞東等人采用基因方法[3]合成了一種改構的人淀粉樣多肽突變體-普蘭林肽;近年來,國內外有關普蘭林肽固相合成研究較多,主要集中在片段合成[4]?？傮w看來,降糖藥物普蘭林肽注射劑給特殊糖尿病患者帶來了福音,但進口普蘭林肽價格昂貴,且難以滿足國內市場的需求,隨著普蘭林肽在糖尿病中治療地位日趨重要,開發(fā)國產(chǎn)普蘭林肽原料藥的合成工藝研究具有重要的意義。

3、
　　普蘭林肽含37個氨基酸以及一對二硫鍵[5]。藥理研究表明,普蘭林肽的1-22個氨基酸及分子內二硫鍵,末端酰胺是其重要的分子生物學功能位點[6],也是合成過程中需要關鍵注意的氨基酸位點。本研究采用Fmoc固相多肽合成法,采用逐步縮合的策略,以RinkAmide-AM樹脂做載體,HBTU-HOBt-DIEA做縮合劑,得到全保護線性普蘭林肽樹脂,以TFA-苯甲硫醚-苯酚-H2O-EDT-TIS配比的裂解液配方脫除保護基團,分別采用

4、空氣,DMSO,雙氧水氧化分子內兩個半胱氨酸的巰基形成一對二硫鍵,制備型RP-HPLC分離純化,氧化前后的普蘭林肽經(jīng)RP-HPLC、ESI-MS、MALDI-TOF-MS和氨基酸組分分析確證,合成了37個氨基酸以及一對二硫鍵的普蘭林肽。
　　目前,研究普蘭林肽的固相合成方法,制備普蘭林肽原料藥是國內多肽藥物開發(fā)的難點之一。探索普蘭林肽的新合成方法,降低合成成本,這將為大規(guī)模生產(chǎn)工藝的實現(xiàn)提供有力的基礎,并為建立多肽固相合成技術平臺

5、提供一定的理論支持。
　　目的:
　　本研究確立了普蘭林肽合成過程以及目標產(chǎn)物的檢測方法,達到了分析鑒定的要求;本研究探索(優(yōu)化)普蘭林肽的固相合成過程中合成方法、裂解方法、氧化方法及純化方法,通過合成過程中條件的優(yōu)化,降低合成普蘭林肽的成本,為工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。
　　方法:
　　1.固相多肽合成中檢測方法:
　　采用Fmoc吸光度法定量檢測氨基酸末端裸露的氨基,定量計算氨基酸的連接效率;茚三酮顏色反應定

6、性檢測氨基酸的連接程度;合成過程使用RP-HPLC和ESI-MS定性觀察合成片段的正確與否。
　　2.普蘭林肽的固相合成:
　　利用標準品Fmoc-Gly-Wang-Resin確定實驗室替代度系數(shù)的校正值;通過選擇縮合劑體系,控制投料摩爾比和反應時間,掌握RinkAmide-AM-Resin的替代度;接肽過程,手工多肽反應柱和多肽合成儀平行進行,探索了縮合反應中樹脂替代度、投料摩爾比、反應時間對普蘭林肽固相合成的影響。

7、>　　通過計算粗品普蘭林肽得率和純度,優(yōu)化普蘭林肽樹脂裂解液配方;三種氧化方法使粗品普蘭林肽分子內二個巰基氧化成環(huán);摸索出適當?shù)闹苽湫蚏P-HPLC條件,制備純化普蘭林肽。
　　純化后普蘭林肽經(jīng)RP-HPLC、ESI-MS、MALDI-TOF-MS和氨基酸組分分析確證。
　　結果:
　　1.Fmoc吸光度法確定實驗室替代度系數(shù)校正值為6L·(mmol·cm)-1,Fmoc-Tyr(tBu)-RinkAmide-Am-R

8、esin替代度為0.25mmol·g-1時最終合成粗品普蘭林肽純度較高。
　　2.縮合劑體系HBTU-HOBt-DIEA成本低,縮合能力強,副反應少,能滿足普蘭林肽固相合成的要求;摩爾投料比為1:5,反應時間150min確定為最優(yōu)固相合成條件;TFA-苯甲硫醚-苯酚-H2O-EDT-TIS配比的裂解液脫除保護基團,粗品得率高,純度大;空氣,DMSO,雙氧水三種方法氧化兩個半胱氨酸的巰基形成一對二硫鍵的比較,雙氧水氧化法為最優(yōu);制備

9、型RP-HPLC純化粗品普蘭林肽取得理想結果。
　　3.合成含37個氨基酸以及一對二硫鍵的普蘭林肽經(jīng)RP-HPLC、ESI-MS、MALDI-TOF-MS、氨基酸組分分析確證,合成正確,粗品純度在50.0％以上,粗品經(jīng)制備型RP-HPLC色譜純化,所得精品普蘭林肽的純度大于95.0%。
　　結論:
　　1.使用手工多肽合成柱和多肽合成儀,采用固相合成方法逐步縮合策略均可以合成全保護線性普蘭林肽樹脂。
　　2.合適

10、的裂解液配方可以使全保護線性普蘭林肽與樹脂分離,并完全脫除普蘭林肽氨基酸的保護基團。
　　3.常用簡單氧化方法可以使線性普蘭林肽分子內成環(huán),雙氧水氧化法簡單方便,中間過程無需過濾純化,無損失。
　　4.制備型反相高效液相分離純化粗品普蘭林肽,得率在50%左右,精品普蘭林肽純度大于95.0%。
　　5.合成多肽經(jīng)RP-HPLC保留時間定位,ESI-MS和MALDI-TOF-MS分子離子峰確證,氨基酸組分分析進行氨基酸結構