大乳頭水螅Wnt-3基因的克隆、生物信息學(xué)分析及原核表達(dá).pdf

1、Wnt蛋白家族是一類通過(guò)自分泌、旁分泌途徑激活不同的Wnt信號(hào)通路的信號(hào)糖蛋白,Wnt介導(dǎo)的信號(hào)通路在動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中廣泛的存在并起重要的調(diào)節(jié)作用。近期完成的水螅核基因組測(cè)序項(xiàng)目結(jié)果顯示,水螅也具有一系列脊椎動(dòng)物Wnt基因的同源基因。許多證據(jù)表明高等動(dòng)物Wnt蛋白家族中的Wnt-3蛋白直接參與動(dòng)物胚胎發(fā)育早期體軸的決定和形成過(guò)程的調(diào)節(jié),因此我們選擇以水螅Wnt-3基因?yàn)橥黄瓶?研究Wnt蛋白在水螅極性體制的決定及形成過(guò)程中作用角色。

2、基于此,本研究圍繞大乳頭水螅Wnt-3基因進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)工作:
　　1.提取大乳頭水螅總RNA,采用SMART技術(shù)制備大乳頭水螅RACE cDNA文庫(kù),再以該文庫(kù)為模板擴(kuò)增了大乳頭水螅Wnt-3基因cDNA序列,PCR產(chǎn)物純化后與克隆載體pMD-18T連接,轉(zhuǎn)化E.coli JM109菌株。運(yùn)用菌落PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆后進(jìn)行DNA測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明大乳頭水螅Wnt-3基因cDNA序列編碼區(qū)全長(zhǎng)序列為1089個(gè)核苷酸,編碼363個(gè)

3、氨基酸。大乳頭水螅Wnt-3基因cDNA序列的成功克隆為深入探討Wnt-3基因的分子進(jìn)化及水螅Wnt-3蛋白的生理功能奠定了基礎(chǔ)。
　　2.基于原核表達(dá)質(zhì)粒pET-LT多酶切位點(diǎn)的特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,以已克隆獲得的pMD18-T-Wnt-3重組質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增大乳頭水螅Wnt-3基因片段(編碼區(qū)cDNA序列的第4位點(diǎn)至867位點(diǎn)),再把該基因片段的PCR產(chǎn)物純化后連接到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-LT上,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-LT-Wn