基于ACP和SSH技術(shù)的不同性別尼羅羅非魚遺傳差異分析.pdf

1、羅非魚是世界性的重要水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象之一，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向全世界推廣的優(yōu)良養(yǎng)殖魚類，我國羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量居世界第一位，其中尼羅羅非魚養(yǎng)殖最為廣泛。尼羅羅非魚體型、生長速度等性狀方面在雌雄不同性別之間存在較大的差異，雄魚的生長速度約比雌魚快40-50％，而到性成熟時(shí)雄魚個(gè)體明顯大于雌魚，嚴(yán)重影響商品魚的整體出池，降低了尼羅羅非魚產(chǎn)量和質(zhì)量。另外由于繁殖快、成熟早，尼羅羅非魚在養(yǎng)殖過程中極易出現(xiàn)繁殖過剩、密度過大、群體生長受阻、營養(yǎng)不良、個(gè)體過

2、小等不利情況，從而直接影響羅非魚的上市規(guī)格。開展性別控制技術(shù)研究，進(jìn)行全雄羅非魚的育種，具有重要的意義。對(duì)于不同性別尼羅羅非魚遺傳差異進(jìn)行分析，將有助于提高全雄羅非魚的育種效率。
　　利用退火控制引物技術(shù)(annealingcontrolprimer)對(duì)尼羅羅非魚不同性別肌肉組織差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，選擇20對(duì)ACP隨機(jī)引物分別對(duì)從同等條件下養(yǎng)殖的尼羅羅非魚群體中的雌、雄魚各5尾組成cDNA池進(jìn)行差異顯示PCR擴(kuò)增，獲得8個(gè)差異表

3、達(dá)的ESTs。除3個(gè)為未知基因外，其余5個(gè)分別為60S核糖體蛋白(RL3)、肌型肌酸激酶M2-CK、小白蛋白β樣蛋白、轉(zhuǎn)錄因子Sox4、轉(zhuǎn)錄變體3(LOC100691543)基因。半定量PCR分析各差異表達(dá)基因在5對(duì)尼羅羅非魚雌雄個(gè)體肌肉組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，篩選到的8個(gè)基因在尼羅羅非魚雌雄個(gè)體肌肉組織中存在表達(dá)差異。對(duì)各差異表達(dá)基因在尼羅羅非魚雌雄魚不同組織中的表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，8個(gè)差異表達(dá)基因中ACP3-X、ACP15-X

4、、60S核糖體蛋白（RL3）、肌型肌酸激酶M2-CK、小白蛋白β樣蛋白和轉(zhuǎn)錄因子Sox4基因在尼羅羅非魚雌魚肌肉組織中的表達(dá)均高于雄魚且差異極為顯著(P＜0.01);轉(zhuǎn)錄變體3(LOC100691543)和ACP6-Y在尼羅羅非魚雄魚肌肉組織中的表達(dá)均高于雌魚，且差異極為顯著(P＜0.01)。結(jié)果顯示，通過ACP技術(shù)獲得了8個(gè)可能參與雌雄魚肌肉生長發(fā)育調(diào)控的ESTs，可以為進(jìn)一步篩選雌雄魚肌肉生長發(fā)育相關(guān)候選基因提供一些參考。
　

5、　利用SSH技術(shù)進(jìn)行了尼羅羅非魚雌魚(XX)基因組差異基因的篩選，選取尼羅羅非魚雌魚(XX)、超雄魚(YY)各10條尾鰭混合樣組成的基因組DNA池，以雌魚基因組DNA為試驗(yàn)方(Tester)，以超雄魚基因組DNA為驅(qū)動(dòng)方(Driver)，采用抑制性消減雜交技術(shù)，構(gòu)建了尼羅羅非魚雌魚的基因組DNA消減雜交文庫。在構(gòu)建的文庫中隨機(jī)挑選1000個(gè)克隆，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序，樣本測(cè)序結(jié)果消除載體序列、接頭序列和低于100bp的序列后獲得了9

6、42條基因組DNA片段。依據(jù)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，共有125條序列注釋到了結(jié)果，序列最長為1229bp，最短為157bp。125個(gè)已知基因包括肌鈣蛋白1(calsequestrin1)、胰島素樣生長因子1受體（insulin-likegrowthfactor1receptor-like，IGF-1R）、60S核糖體蛋白L36a(60SribosomalproteinL36a，partial)等基因。對(duì)尼羅羅非魚雌魚(XX)消減文庫樣本中所

7、有ESTs進(jìn)行GO分類發(fā)現(xiàn)，與分子功能分類(MolecularFunction)相關(guān)的ESTs中與分子綁定(binding)和催化活性(catalyticactivity)功能相關(guān)的ESTs最多。與細(xì)胞組成分類(CellularComponent)相關(guān)的ESTs主要集中在細(xì)胞組成(cellpart)和細(xì)胞(cell)功能上。在與生物過程功能分類(BiologicalProcess)相關(guān)的ESTs中，與細(xì)胞過程(cellularproce

8、ss)和代謝過程(metabolicprocess)相關(guān)的最多。KEGGpathway分析后，得知消減雜交文庫中的基因參與了泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitinproteasomepathway)以及胰島素信號(hào)通路(Insulinsignalingpathway)等代謝過程。這為進(jìn)一步研究尼羅羅非魚雌魚(XX)特異性分子標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。
　　尼羅羅非魚超雄魚(YY)基因組差異基因的篩實(shí)驗(yàn)中，以超雄魚基因組DNA為試驗(yàn)方(Test

9、er)，以雌魚基因組DNA為驅(qū)動(dòng)方(Driver)，采用抑制性消減雜交技術(shù)，構(gòu)建了尼羅羅非魚超雄魚的基因組DNA消減雜交文庫。在構(gòu)建的文庫中隨機(jī)挑選1000個(gè)克隆，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序，樣本測(cè)序結(jié)果消除載體序列、接頭序列和低于100bp的ESTs序列后獲得了924條基因組DNA片段。測(cè)序結(jié)果在blastx網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)共有131條序列注釋到了結(jié)果，最長為1270bp，最短為166bp。131個(gè)已知基因中包括肌球蛋白VIIa樣蛋白

10、(myosin-VIIa-like)、生長分化因子6-a（growthdifferentiationfactor6-a-like）、抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白(utrophin)、驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白KIF15-A(kinesin-likeproteinKIF15-A-like)、等基因。對(duì)尼羅羅非魚超雄魚消減文庫樣本中所有ESTs進(jìn)行GO分類發(fā)現(xiàn)，與分子功能分類相關(guān)的ESTs中與分子綁定和催化活性功能相關(guān)的ESTs最多;與細(xì)胞組成分類相關(guān)的EST

11、s中與細(xì)胞組成和細(xì)胞功能相關(guān)的ESTs數(shù)目最多;與生物過程功能分類相關(guān)的ESTs中，與細(xì)胞過程和代謝過程相關(guān)的ESTs最多。KEGGpathway分析后，得知消減雜交文庫中的基因參與了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體通路(ABCtransporters)、TGF-beta信號(hào)通路(TGF-betasignalingpathway)、鈣離子信號(hào)通道(Calciumsignalingpathway)等代謝過程。為進(jìn)一步獲得YY型尼羅羅非魚超雄魚特異性標(biāo)記基因奠