玉米源八氫番茄紅素脫氫酶的原核表達.pdf

1、本論文分為兩個部分，第一部分為玉米源八氫番茄紅素脫氫酶的原核表達，第二部分為雙基因沉默RNAi表達載體的構建與分析。
　　 采用植物體內(nèi)的某種酶為除草劑的靶標，進行高通量篩選是除草劑創(chuàng)制的重要領域。八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS)作為除草劑領域的重要靶標酶，是除草劑開發(fā)的熱點。本研究對PDS酶進行了表達和純化，為基于PDS酶的高通量除草劑篩選奠定了基礎。
　　 保持玉米源八氫番茄紅素脫

2、氫酶的氨基酸序列不變，根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子反翻譯八氫番茄紅素脫氫酶的編碼基因，采用密碼子優(yōu)化原則設計合成編碼八氫番茄紅素脫氫酶的基因片段PDS。將基因片段插入到融合載體pET-30c(+)形成載體pET-PDS，轉化進入大腸桿菌BL21(DE3)。
　　 對重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-PDS進行誘導表達，選擇IPTG終濃度及誘導溫度為考察因子，確定最優(yōu)表達條件為IPTG終濃度1 mmol/L，誘導溫度25℃，誘導培

3、養(yǎng)4 h。在最適表達條件下對重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-PDS進行培養(yǎng)，采用超聲波破碎法將菌體破碎，經(jīng)SP FF親和層析和SP離子交換層析，純化得到的目的蛋白。
　　 實驗結果顯示未經(jīng)密碼子優(yōu)化的核酸序列在大腸桿菌中的表達量較低，而人工合成的優(yōu)化了密碼子的核酸序列在預期位置即63 kDa左右處有較明顯表達帶，其表達量占大腸桿菌菌體總蛋白的27.6％。
　　 聯(lián)合幾種不同的目的基因進行RNA干擾可能達到更好的基

4、因沉默效果，但不同表達元件之間的相互關系對干擾效果也可能有一定的影響。本實驗構建了PolⅡ啟動子apoA-Ⅰ啟動子調控的靶向綠色熒光蛋白以及靶向hTERT的單基因和雙基因RNA干擾載體，通過綠色熒光蛋白在肝癌細胞SMMC-7721中的表達量以及hTERT mRNA的表達量來考察基因的沉默效果。結果表明，雙基因RNAi載體的RNAi活性高于單基因RNAi載體，且不同方向組合的兩個表達元件所誘導的基因沉默效果沒有顯著差異，說明兩個干擾元件之