八氫番茄紅素合成酶基因轉(zhuǎn)化綠藻的初步研究.pdf

1、本文主要研究了綠藻的基因工程,主要內(nèi)容包括綠藻的無菌純化、八氫番茄紅素合成酶基因的克隆、綠藻外源八氫番茄紅素合成酶基因轉(zhuǎn)化體系的建立和陽性轉(zhuǎn)化子的篩選四部分。本文主要以杜氏鹽藻細(xì)胞和雨生紅球藻細(xì)胞作為研究對象。
　　 目前對于利用基因工程手段將外源基因轉(zhuǎn)入到微藻中的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)有所報(bào)道,通過對藻類基因工程的研究,不僅可以從改造的藻體中篩選出抗性強(qiáng)且生長快的優(yōu)良藻種,并把藻類作為新型的生物反應(yīng)器生產(chǎn)某種特殊的有用物質(zhì)；而且還可以從藻類

2、中分離、克隆有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因,作為農(nóng)作物改良的目的基因或用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)。另外,近年來利用藻類為宿主的基因產(chǎn)物的生產(chǎn)也日益受到關(guān)注。因此藻類生物技術(shù),尤其是微藻生物技術(shù)將成為人類21世紀(jì)微生物技術(shù)發(fā)展的重要方向。
　　 阿特拉津(Atrazine)是一種除草劑,通過抑制光合作用使雜草死亡,一定濃度的阿特拉津可將杜氏鹽藻細(xì)胞和雨生紅球藻細(xì)胞致死。由于杜氏鹽藻和雨生紅球藻對潮霉素不敏感,而pCAMBIA1301質(zhì)粒上的抗性為h

3、ygromycin基因抗性。因此可以把pCAMBIA1301質(zhì)粒上的hygromycin基因替換成atzA基因。因此,atzA基因可作為一種篩選標(biāo)記基因用于陽性轉(zhuǎn)化子的篩選。
　　 主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.首先對藻種進(jìn)行純化,結(jié)合低速重復(fù)洗滌法、連續(xù)傳代法、加入少量氯霉素的方法,得到較純凈的液體鹽藻細(xì)胞。然后將純化后的液體培養(yǎng)物在1％瓊脂鹽藻固體培養(yǎng)板上培養(yǎng),再將單藻落挑取、液體培養(yǎng),從而得到純凈的藻種。

4、r>　　 2.提取番茄、辣椒、擬南芥和鹽藻的RNA,通過反轉(zhuǎn)錄的方法得到cDNA,根據(jù)GenBank公布的EF534740設(shè)計(jì)番茄引物對psy-lc-F/psy-le-R;根據(jù)GenBank公布的X68017設(shè)計(jì)辣椒的引物對psy-lc-F/psy-ca-R；根據(jù)GenBank公布的NM121729設(shè)計(jì)擬南芥引物對psy-at-F/psy-at-R,分別從番茄、辣椒、擬南芥中克隆出八氫番茄紅素合成酶(psy)基因。
　　 3.

5、提取鹽藻的基因組,根據(jù)GenBank公布的M77506設(shè)計(jì)引物cbr-p-F/cbr-p-R從中克隆出cbr基因。
　　 4.用引物atzA-7/atzA-8從pMD-4質(zhì)粒中克隆出atzA基因。使用Xhol切掉pCAMBIA1301質(zhì)粒上的hygromycin基因片段,去磷酸化；對atzA同樣用XhoI進(jìn)行酶切,然后與去磷酸化的pCAMBIA1301載體連接成一個(gè)完整的載體。使用BsrBI對cbr-psy-T酶切,回收cbr-

6、psy片段,然后將cbr-psy基因片段插入到atzA-1301質(zhì)粒中去,通過檢測篩選出正向陽性質(zhì)粒。
　　 5.使用電擊轉(zhuǎn)化法或者農(nóng)桿菌侵染法將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入綠藻細(xì)胞,然后進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的檢測。使用6 kV/cm,1×高鹽HEPES電擊緩沖液,番茄X46的質(zhì)粒對杜氏鹽藻細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)化已長出單藻落。使用6kV/cm,1×高鹽HEPES電擊緩沖液,pGreen0029-atAz的質(zhì)粒對紅球藻進(jìn)行電轉(zhuǎn)化已長出單藻落。