原殼小球藻八氫番茄紅素脫氫酶和ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因的克隆和分析.pdf

1、類胡蘿卜素(carotenoids)是類異戊二烯化合物及其通過氧化氫化脫氫環(huán)化酮基化,以及碳架的重排降解等作用的衍生物,廣泛存在于花卉水果蔬菜藻類細(xì)菌真菌中,分為不含氧原子的胡蘿卜素(carotenes)族和含氧官能團(tuán)(如羥基環(huán)氧基甲氧基等)的衍生物及其酯類的葉黃素(xanthophylls)族由于富含葉黃素等類胡蘿卜素,小球藻(Chlorella)作為一種極具潛力的葉黃素源而備受關(guān)注目前關(guān)于小球藻類胡蘿卜素的研究中,主要采用培養(yǎng)條件的

2、優(yōu)化和提取工藝的改進(jìn)來提高葉黃素產(chǎn)量,少見采用代謝途徑改造等基因工程的辦法來實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)本論文將類胡蘿卜素代謝過程中關(guān)鍵限速酶八氫番茄紅素脫氫酶(phetoene desaturase,PDS)和ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ζ-carotene desaturase,ZDS)的基因作為研究對象,通過對原殼小球藻(Chlorella protothecoides CS-41)PDS ZDS基因的克隆和特征分析,為進(jìn)一步揭示類胡蘿卜素合成的分子代謝

3、機(jī)制奠定基礎(chǔ),此外,還對原殼小球藻的遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了初步的探索主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1、通過cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)和RT-PCR對C. protothecoides CS-41核基因組上的PDS ZDS基因進(jìn)行擴(kuò)增,得到2054bp PDS基因的cDNA序列(GenBank登錄號:FJ968162),及大小分別為3857bp(GenBank登錄號:GU269620)和1802bp(GenBank登錄號:GU26

4、9621)的兩條PDS基因的DNA序列;以及得到了2031bp ZDS基因的cDNA序列(GenBank登錄號:GU269622)及其4713bp的DNA序列(GenBank登錄號:GU269623)
　　2、通過PDS ZDS基因?qū)?yīng)的氨基酸序列的生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)它與高等植物和其它藻類的相應(yīng)基因具有很高的相似性,在PDS ZDS基因?qū)?yīng)的氨基酸序列中都發(fā)現(xiàn)了三個類似的功能區(qū)域:典型的雙核苷酸結(jié)合位點(diǎn)底物運(yùn)輸結(jié)合位點(diǎn)和類胡蘿卜

5、素的結(jié)合位點(diǎn),并在N端都發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)運(yùn)肽的存在同時,進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,藻類群中小球藻和衣藻的親緣關(guān)系比較近
　　3、成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-PDS,通過IPTG誘導(dǎo),使PDS基因在宿主菌BL21(DE3)中成功地高效表達(dá),并通過Western blot免疫印跡法分析,進(jìn)一步表明所表達(dá)的融合蛋白就是PDS通過顏色互補(bǔ)反應(yīng),證實(shí)了PDS蛋白能夠催化兩步脫氫反應(yīng),將無色的八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化成淺黃色的ζ-胡蘿卜素,同時也證明了原殼小球藻

6、的PDS蛋白屬于植物型的八氫番茄紅素脫氫酶
　　4、通過研究原殼小球藻對六種常用抗生素的敏感性,確定了原殼小球藻遺傳轉(zhuǎn)化可以采用的篩選抗生素種類及其工作濃度,發(fā)現(xiàn)原殼小球藻對G418最敏感,工作濃度為10μg/ml,為后續(xù)的原殼小球藻基因工程研究奠定了基礎(chǔ)
　　5、以載體pHB為基礎(chǔ),成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pHB-PDS,初步嘗試通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將植物表達(dá)載體pHB-PDS轉(zhuǎn)入模式生物擬南芥中,成功獲得了抗性植株,其功能驗(yàn)證