利用高蛋白解脂亞羅維亞酵母轉(zhuǎn)化菊粉生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的研究.pdf

1、近年來(lái),用于食品和飼料的蛋白質(zhì)需求量正在不斷增加。單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)技術(shù)為解決全球蛋白質(zhì)短缺的問(wèn)題提供了一條可行之路。單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)作為一個(gè)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程,將低成本的的原材料轉(zhuǎn)變成了擁有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值的產(chǎn)品。而選擇廉價(jià)的原料對(duì)于控制單細(xì)胞的蛋白生產(chǎn)的成本至關(guān)重要。菊粉作為植物的一種貯存性多糖,主要存在于如菊芋、菊苣、大麗花和雪蓮果等植物的根莖中。作為一種可再生,廉價(jià)和來(lái)源豐富的原材料,菊粉資源得到越來(lái)越多的重視。這些優(yōu)勢(shì)使菊粉和含菊粉

2、的植物成為SCP工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)原材料。
　　 從酵母Kluyveromyces marxianus CBS6556中克隆的INU1基因連接到了分泌型表達(dá)質(zhì)粒pINA1317,并且在高蛋白海洋酵母Yarrowia lipolytica SWJ-1b中得到表達(dá)。使原本不能分泌菊粉酶的Y.lipolytica SWJ-1b,能夠直接利用菊粉生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。細(xì)胞生長(zhǎng)80h后,重組菌株分泌的菊粉酶酶活達(dá)到了43.1±0.9U／ml。采用

3、單次因子方法優(yōu)化了產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的最適培養(yǎng)基和最適條件,得到最適培養(yǎng)基組分為(w／v):菊粉4％,豆餅粉水解液4％,(NH4)2SO40.1％,初始pH為6。最佳培養(yǎng)條件為,在28℃和180 rpm振蕩培養(yǎng)88h。在以上條件下培養(yǎng),細(xì)胞干重達(dá)到19.5g／1,蛋白含量為38.7％(w／w),總蛋白量為7.54g／l。當(dāng)該工程酵母菌在含有4.0％的菊粉(w／v)培養(yǎng)基中通過(guò)2-1發(fā)酵罐發(fā)酵72h后,細(xì)胞的粗蛋白含量、細(xì)胞干重、還原糖含量和總

4、糖的利用率分別達(dá)到47.5％(w／w)、20.1g／l、0.6±0.1 g／l和96.4％(w／w)。當(dāng)酵母工程菌在含有8％的菊芋(w／v)培養(yǎng)基中通過(guò)過(guò)2-1發(fā)酵罐發(fā)酵80h后,細(xì)胞的粗蛋白含量、細(xì)胞干重、還原糖和總糖的利用率分別達(dá)到53.7％(w／w)、20.8 g／l、1.3±0.2 g／l和94.2％(w／w)。所以,Y.lipolytica的重組菌株能夠很好的利用菊粉以及含有菊粉的作物生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。
　　 使用親和層

5、析法純化了重組菊粉酶。SDS-PAGE結(jié)果表明純化的重組菊粉酶的分子量約為84 kDa。純化的重組菊粉酶最適作用溫度為50℃,50℃以下具有良好的穩(wěn)定性；最適作用pH為4.5,在pH5.0—9.5之間有良好的穩(wěn)定性； Na+和Zn2+對(duì)其酶活有激活作用,Co2+、Ba2+、K+、Hg2+、Cu2+、Ag+和Ni2+對(duì)其酶活有抑制作用,其中Ag+和Hg2+表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用；蛋白抑制劑SDS對(duì)其酶活有較強(qiáng)的抑制作用；對(duì)菊粉的Km值為16