利用原生質(zhì)體融合技術(shù)降解玉米秸桿生產(chǎn)單細胞蛋白的研究.pdf

1、秸桿資源是我國豐富的能量資源，也是自然界中存在最廣泛的一類碳水化合物，同時它也是地球上數(shù)量最大的再生資源。由于秸桿的組分不易分解，其利用率很低。秸桿中主要成分是木質(zhì)纖維素，包括木質(zhì)素、纖維素和半纖維素。它們只有一小部分得到了利用，絕大多數(shù)浪費的同時還造成環(huán)境污染。利用微生物生產(chǎn)的纖維素酶將其轉(zhuǎn)化為人類急需的能源物質(zhì)，對于人類社會解決環(huán)境污染、食物短缺和能源危機具有重大的現(xiàn)實意義。 本論文采用能夠有效降解木質(zhì)素和纖維素的菌株白腐

2、真菌和康寧木霉作為出發(fā)菌株進行實驗，最終有效生產(chǎn)單細胞蛋白。本論文內(nèi)容主要包括：木質(zhì)素酶和纖維素酶高產(chǎn)菌株的產(chǎn)酶條件的研究；康寧木霉和白腐真菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究；康寧木霉和白腐真菌混菌發(fā)酵條件的優(yōu)化研究；康寧木霉和白腐真菌原生質(zhì)體融合條件的研究；融合子性質(zhì)性能鑒定；親本和融合子產(chǎn)酶的分離和純化研究；酵母和融合子混菌發(fā)酵產(chǎn)單細胞蛋白的研究。經(jīng)過大量實驗工作，得到了如下結(jié)果： 1)利用正交試驗確定康寧木霉和白腐真菌混合發(fā)酵的最佳

3、培養(yǎng)基組成：秸稈：麩皮為5：1，硫酸銨1.4％，硫酸鎂0.05％，磷酸二氫鉀0.05％，硫酸亞鐵0.01％，硫酸錳0.01％，硫酸亞鐵0.01％，硫酸錳0.01％，氯化鈉0.5％，pH6.5。培養(yǎng)溫度28-30℃，轉(zhuǎn)數(shù)180r/min，接種時間間隔為48h，混合菌的接種量3％，裝液量40mL/250mL。在此條件下混合菌的產(chǎn)酶高峰期由5-6d縮短為4-5d，優(yōu)化后酶活力的平均值FPA為2.53U，CMCase為3.08U，分別比優(yōu)化以前

4、提高了1.08U和1.44U；PODcase為7.98U，比優(yōu)化前提高了2.69U。 2)單因素實驗探討康寧木霉和白腐真菌的對數(shù)生長中期分別是10-40h和50-100h，在此生長期內(nèi)以0.7％的氯化納為滲透壓穩(wěn)定劑，0.1％二硫蘇糖醇為脫壁促進劑，以正交實驗探討纖維素酶和蝸牛酶的配比分別為2∶1和1∶1，酶濃度為2％，酶解時間3h，酶解溫度為30℃條件下完成兩菌株的原生質(zhì)體制備和再生。 3)從多種真菌抑制劑中試驗挑

5、選真菌抑制劑氟康唑作為親本生長的抗藥性標記篩選，白腐真菌在濃度為400μg/mL的條件下抑制生長。康寧木霉的原生質(zhì)體在硫酸二乙酯與紫外復(fù)合處理條件下滅活。 4)采用35％PEG6000作為促融合劑，0.1mmol/LCaCl2參與的條件下，25℃，25min進行融合，獲得7株融合子，其中2株穩(wěn)定傳代。 5)采用與親本的菌落特征對比，生長曲線比較，酶活力比較，蛋白全細胞電泳，同工酶電泳，確定融合子與親本的遺傳相關(guān)性和差

6、異性，鑒定融合子的形成。 6)親本和融合子的發(fā)酵粗酶液分別經(jīng)過硫酸銨鹽析，利用SephadexG-100柱兩次過柱分離純化纖維素酶和木質(zhì)素酶，融合子富含纖維素酶活和過氧化物酶活，親本白腐真菌含有過氧化物酶活，康寧木霉含有濾紙酶活和羧甲基纖維素酶活。以薄層層析和高效液相色譜對比融合子與親本發(fā)酵產(chǎn)物。 7)對融合子的發(fā)酵能力和條件進行了摸索，通過正交試驗獲得了融合子產(chǎn)酶的最適條件為硫酸銨氮源，pH為5.5，1.0％的麩皮