Pub1-RRM2-RRM12的結(jié)構(gòu)功能研究及RIG-I-TRIM25的表達(dá)純化.pdf

1、一、釀酒酵母Pub1-RRM2/Pub1-RRM12的結(jié)構(gòu)功能研究
　　 真核生物的基因表達(dá)需要經(jīng)歷若干步驟，并受到轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平上的嚴(yán)密地調(diào)控。正常的mRNAs需要被降解以防止蛋白過量表達(dá)；異常的mRNAs亦需要被降解，以防止合成具有毒性的截短蛋白。一些mRNA降解通路已經(jīng)得到較多的研究以揭示參與mRNA降解的相應(yīng)的機(jī)制和分子。在這些研究得較為明確的通路中，正常mRNAs的降解依賴于去腺苷酸化的mRNA降解通路，而異常m

2、RNAs的降解則依賴于Nonsense-mediated mRNA decay，Non-stop decay and No-Go Decay等通路。一些在mRNA降解通路中起作用的特殊序列已被詳細(xì)描述，包括在轉(zhuǎn)錄本3'非翻譯區(qū)的AU富集元件(AREs)，上游開放閱讀框(uORF)和起始密碼子之間的穩(wěn)定子元件(STEs)等。
　　 已有的研究表明，Pub1蛋白在體內(nèi)結(jié)合多聚腺苷酸化的RNA，并且，在體外，Pub1在具有高鹽濃度的

3、溶液中仍然可以結(jié)合Poly(U)。在釀酒酵母中，有一部分(約10％)的mRNA以依賴Pub1的方式進(jìn)行降解。Pub1通過識(shí)別特殊的序列元件(如ARE和STE)和于其他蛋白相互作用而影響mRNA的降解。Pub1結(jié)合ARE元件從而干擾ARE誘導(dǎo)的去腺苷酸化過程，因此可以穩(wěn)定mRNAs。STE元件被Pub1識(shí)別亦可保護(hù)mRNA不被NMD途徑降解。除了在mRNA降解方面扮演著調(diào)控角色外，Pub1還參與了其他一些如mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)以及翻譯等過程。

4、r>　　 我們解析了Pub1第二個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域(RRM2)和前兩個(gè)串聯(lián)RRM結(jié)構(gòu)域(RRM12)的晶體結(jié)構(gòu)。RRM1和RRM2均采取經(jīng)典RRM結(jié)構(gòu)的三明治折疊方式，其識(shí)別Poly(U)的機(jī)制與果蠅中SXL蛋白的RRM結(jié)構(gòu)域相似。結(jié)合結(jié)構(gòu)分析和生化實(shí)驗(yàn)，我們鑒定出參與Poly(U)識(shí)別的關(guān)鍵殘基；與單獨(dú)的RRM結(jié)構(gòu)域相比，串聯(lián)的RRM具有與Poly(U)更高的結(jié)合親和力。分子篩和分析超速離心實(shí)驗(yàn)表明，即使在用于晶體生長(zhǎng)的蛋白濃度條件下，

5、Pub1-RRM12在溶液中仍以單體形式存在。因此，在晶體結(jié)構(gòu)中觀察到的Pub1-RRM12的二聚現(xiàn)象是由晶體堆積造成的。RRM2和RRM12結(jié)構(gòu)的解析為闡明Pub1結(jié)合RNA提供了分子水平上的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)Pub1的生物學(xué)功能發(fā)揮作了初步探討。
　　 二、人源RIG-I-CARD和TRIm25-SPRY的克隆表達(dá)純化與晶體生長(zhǎng)
　　 在進(jìn)化過程中，生命體進(jìn)化出了用于抵抗入侵病原體的保護(hù)機(jī)制。這些保護(hù)機(jī)

6、制對(duì)于宿主清除來自環(huán)境中的危險(xiǎn)因子是至關(guān)重要的。在人中，有兩類被稱為天然免疫和適應(yīng)性免疫的重要機(jī)制。與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)不同，天然免疫系統(tǒng)有著更古老的起源，并不以分子特異的方式識(shí)別病原體。宿主用于識(shí)別病原體相關(guān)分子模式的受體稱為模式識(shí)別受體，它們?cè)诩棺祫?dòng)物，無脊椎動(dòng)物和植物中是保守的。
　　 RIG-Ⅰ屬于RLR家族，是一類模式識(shí)別受體。RIG-Ⅰ有三個(gè)結(jié)構(gòu)域：用于和IPS-1結(jié)合的N端串聯(lián)CARD結(jié)構(gòu)域，一個(gè)中間的解旋酶結(jié)構(gòu)域，一