利用DNA四面體納米結(jié)構(gòu)單分子定量檢測生物分子.pdf

1、單分子檢測(single-molecule detection，SMD)是一種在單分子水平獲取信息的研究手段。通過對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行研究，可以揭示分子之間被宏觀所掩蓋的微小差異。SMD可以在單分子水平上研究生物分子的構(gòu)象變化、動(dòng)力學(xué)、分子之間的相互作用、單分子操縱以及單分子定量檢測。單分子定量檢測是分析化學(xué)的最終目標(biāo)。在單分子定量檢測中最常用的是單分子計(jì)數(shù)法。該方法具有高檢測靈敏度、高分辨率等優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)的依據(jù)強(qiáng)度進(jìn)行定量的方法相比，單分子

2、計(jì)數(shù)是根據(jù)目標(biāo)分子的個(gè)數(shù)進(jìn)行定量，更適宜于超低濃度下生物分子的定量檢測。
　　MicroRNA（miRNA）的表達(dá)已經(jīng)被證明和大多數(shù)癌癥如乳腺癌、甲狀腺癌、直腸癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌等的監(jiān)管和發(fā)展有關(guān)。監(jiān)測miRNA生物標(biāo)志物的變化能夠用于預(yù)示疾病的早期狀態(tài)。但是，對(duì)miRNA的定量檢測總是因?yàn)樗鼈兊男〕叽?、序列的相似性和相關(guān)的在細(xì)胞中的超低表達(dá)而十分棘手。因此，需要發(fā)展一種可以對(duì)miRNA進(jìn)行靈敏和特異性檢測的方法。

3、　　近年來，隨著DNA納米技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者們以DNA鏈為原料，通過堿基之間的互補(bǔ)配對(duì)構(gòu)建出了許多二維和三維的結(jié)構(gòu)DNA納米材料，并且開始把這些材料利用到生物傳感和納米器械等領(lǐng)域。這些結(jié)構(gòu)DNA納米材料的發(fā)展也為分析化學(xué)的發(fā)展提供了有力的工具。
　　基于上面的論述，本論文組裝了一種基于DNA四面體的新熒光納米探針用于蛋白質(zhì)的單分子檢測并且構(gòu)建帶有toehold發(fā)卡的DNA四面體基底用于單個(gè)miRNA的靈敏、特異性檢測。

4、　　本論文共分為三章:
　　第一章為緒論部分，主要介紹了單分子檢測和單分子定量檢測的背景、檢測意義、檢測原理、常用的檢測方法，系統(tǒng)的分析了利用熒光成像技術(shù)進(jìn)行單分子定量檢測時(shí)常用的熒光探針存在的一些不足之處以及在基底上進(jìn)行單分子檢測時(shí)非特異性吸附的影響。此外還介紹了miRNA的一些常用的檢測方法以及結(jié)構(gòu)DNA納米材料的發(fā)展及其在生物傳感方面的應(yīng)用。
　　在第二章中，設(shè)計(jì)了基于DNA四面體的新熒光納米探針，并成功用于蛋白質(zhì)的單

5、分子定量檢測。該DNA四面體納米探針在單分子檢測中的使用，通過防止自猝滅和增加熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性，克服了有機(jī)染料的不足，避免了量子點(diǎn)的生物毒性和眨眼現(xiàn)象。在利用該熒光探針結(jié)合熒光單分子計(jì)數(shù)法對(duì)人IgG的定量檢測時(shí)，得到的線性范圍為3.0×10-14molL-1-1.0×10-12molL-1，相關(guān)系數(shù)為0.9997，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.09％(n=3)。同時(shí)方法還顯示了很好的特異性和較低的基質(zhì)效應(yīng)。
　　在第三章中，設(shè)計(jì)了帶有

6、toehold發(fā)卡的DNA四面體基底用于靈敏和特異性檢測miRNA。在基底上加入目標(biāo)miRNA之后，通過toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)打開發(fā)卡，再與信號(hào)探針結(jié)合可進(jìn)行單分子計(jì)數(shù)。而和目標(biāo)miRNA序列高度相似的錯(cuò)配miRNA則不能打開發(fā)卡，或者打開發(fā)卡的速度很慢，通過控制反應(yīng)時(shí)間，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)miRNA的靈敏和特異性檢測。論文中對(duì)構(gòu)建的基底進(jìn)行了一系列的表征，并且優(yōu)化了反應(yīng)時(shí)間和toehold堿基數(shù)(5nt、6nt、7nt和8nt)。