利用DNA四面體納米結構單分子定量檢測生物分子.pdf

1、單分子檢測(single-molecule detection，SMD)是一種在單分子水平獲取信息的研究手段。通過對單個分子進行研究，可以揭示分子之間被宏觀所掩蓋的微小差異。SMD可以在單分子水平上研究生物分子的構象變化、動力學、分子之間的相互作用、單分子操縱以及單分子定量檢測。單分子定量檢測是分析化學的最終目標。在單分子定量檢測中最常用的是單分子計數(shù)法。該方法具有高檢測靈敏度、高分辨率等優(yōu)勢。與傳統(tǒng)的依據(jù)強度進行定量的方法相比，單分子

2、計數(shù)是根據(jù)目標分子的個數(shù)進行定量，更適宜于超低濃度下生物分子的定量檢測。
　　MicroRNA（miRNA）的表達已經(jīng)被證明和大多數(shù)癌癥如乳腺癌、甲狀腺癌、直腸癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌等的監(jiān)管和發(fā)展有關。監(jiān)測miRNA生物標志物的變化能夠用于預示疾病的早期狀態(tài)。但是，對miRNA的定量檢測總是因為它們的小尺寸、序列的相似性和相關的在細胞中的超低表達而十分棘手。因此，需要發(fā)展一種可以對miRNA進行靈敏和特異性檢測的方法。

3、　　近年來，隨著DNA納米技術的不斷發(fā)展，研究者們以DNA鏈為原料，通過堿基之間的互補配對構建出了許多二維和三維的結構DNA納米材料，并且開始把這些材料利用到生物傳感和納米器械等領域。這些結構DNA納米材料的發(fā)展也為分析化學的發(fā)展提供了有力的工具。
　　基于上面的論述，本論文組裝了一種基于DNA四面體的新熒光納米探針用于蛋白質的單分子檢測并且構建帶有toehold發(fā)卡的DNA四面體基底用于單個miRNA的靈敏、特異性檢測。

4、　　本論文共分為三章:
　　第一章為緒論部分，主要介紹了單分子檢測和單分子定量檢測的背景、檢測意義、檢測原理、常用的檢測方法，系統(tǒng)的分析了利用熒光成像技術進行單分子定量檢測時常用的熒光探針存在的一些不足之處以及在基底上進行單分子檢測時非特異性吸附的影響。此外還介紹了miRNA的一些常用的檢測方法以及結構DNA納米材料的發(fā)展及其在生物傳感方面的應用。
　　在第二章中，設計了基于DNA四面體的新熒光納米探針，并成功用于蛋白質的單

5、分子定量檢測。該DNA四面體納米探針在單分子檢測中的使用，通過防止自猝滅和增加熒光強度和光穩(wěn)定性，克服了有機染料的不足，避免了量子點的生物毒性和眨眼現(xiàn)象。在利用該熒光探針結合熒光單分子計數(shù)法對人IgG的定量檢測時，得到的線性范圍為3.0×10-14molL-1-1.0×10-12molL-1，相關系數(shù)為0.9997，方法的相對標準偏差為5.09％(n=3)。同時方法還顯示了很好的特異性和較低的基質效應。
　　在第三章中，設計了帶有

6、toehold發(fā)卡的DNA四面體基底用于靈敏和特異性檢測miRNA。在基底上加入目標miRNA之后，通過toehold介導的鏈置換反應打開發(fā)卡，再與信號探針結合可進行單分子計數(shù)。而和目標miRNA序列高度相似的錯配miRNA則不能打開發(fā)卡，或者打開發(fā)卡的速度很慢，通過控制反應時間，可以實現(xiàn)對目標miRNA的靈敏和特異性檢測。論文中對構建的基底進行了一系列的表征，并且優(yōu)化了反應時間和toehold堿基數(shù)(5nt、6nt、7nt和8nt)。