牛凝乳酶基因在Bacillus megaterium WH320中的表達(dá)研究.pdf

1、凝乳酶是奶酪工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵酶制劑，目前主要從動(dòng)物組織提取獲得，酶源嚴(yán)重不足。盡管研究已發(fā)現(xiàn)多種動(dòng)物和植物均含有凝乳酶，但相比之下，以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)較從動(dòng)植物中提取更具有顯著優(yōu)勢(shì)，是解決該酶制劑來源，降低成本的有效途徑。為此，自20世紀(jì)90年代以來，國外利用生物工程技術(shù)生產(chǎn)凝乳酶的研究廣泛開展，而國內(nèi)在這方面研究尚較為匱缺，報(bào)道不多。
　　 為推進(jìn)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)凝乳酶的進(jìn)程，本研究首先開展了野生型高產(chǎn)凝乳酶的微生物菌株的篩選

2、，得到3株國內(nèi)外至今尚未報(bào)道的，產(chǎn)凝乳酶的氣單胞菌(Aeromonas spp)新菌株C31、C41和C42，不過，鑒于這些菌株均為人類致病菌，不適合用于生產(chǎn)凝乳酶制劑?；谂Ｄ槊敢驯粡V泛用于奶酪生產(chǎn)，進(jìn)一步從GenBank數(shù)據(jù)庫獲取該酶的基因序列，根據(jù)牛凝乳酶的原酶與活性酶之間的氨基酸序列差異及表達(dá)系統(tǒng)對(duì)密碼子的偏好性對(duì)基因片段進(jìn)行優(yōu)化，合成該基因，利用巨大芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建該基因的表達(dá)載體pHIS1525-RC，以木糖為誘導(dǎo)物

3、，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)PCR、雙酶切、蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳和酶活力檢測(cè)等方法驗(yàn)證，本研究在國內(nèi)外首次利用巨大芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)具有生物活性的牛凝乳酶基因(N0.180994)。利用Ni-NTA層析對(duì)表達(dá)酶進(jìn)行分離純化，分析其酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明，所表達(dá)的牛凝乳酶與天然酶的酶學(xué)性質(zhì)幾乎完全相同，分子量為35.6 kDa，最適作用溫度為45℃，20℃～50℃下具有較好的熱穩(wěn)定性，保溫30 min尚保持75%以上酶活，

4、70℃處理30min酶活幾乎完全喪失。最適作用pH為5.0，pH4.6～5.8下酶活保持80%以上，在pH3.0～7.4范圍內(nèi)酶活比較穩(wěn)定，在低于pH3.0或高于pH7.4活性迅速降低。進(jìn)一步優(yōu)化重組菌株WH320-RC的產(chǎn)酶培養(yǎng)條件，結(jié)果顯示最適碳源為果糖，葡萄糖對(duì)產(chǎn)酶強(qiáng)烈抑制，最適氮源為酵母粉和牛肉膏，最適培養(yǎng)溫度為37℃，最適培養(yǎng)pH為7.0，0.5%的木糖對(duì)酶表達(dá)的誘導(dǎo)效果最好，濃度過高或過低均不利用誘導(dǎo)，培養(yǎng)基添加0.2%的吐

5、溫-80可使產(chǎn)酶量提高30%。將所合成的基因成功構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體pET-22b-RC和pQE30-RC，但在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)[BL21(DE3)和M15菌株]未能有效表達(dá)，這可能是巨大芽孢桿菌和大腸桿菌二個(gè)表達(dá)載體對(duì)密碼子的偏好性不同所致，有待進(jìn)一步研究。
　　 本研究通過對(duì)牛凝乳酶基因的序列進(jìn)行優(yōu)化、合成，利用巨大芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)WH320成功實(shí)現(xiàn)了活力表達(dá)，得到了具有凝乳酶活性的表達(dá)產(chǎn)品，為我國生物工程技術(shù)的方法自主生產(chǎn)