嗅鞘細(xì)胞和支鏈氨基酸對視神經(jīng)損傷的修復(fù)作用.pdf

1、視神經(jīng)損傷和變性疾患常導(dǎo)致視覺功能不可逆性損害。視神經(jīng)屬于中樞神經(jīng)，因此缺乏自發(fā)性再生能力，其損傷將導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（節(jié)細(xì)胞）死亡。因此針對促進(jìn)節(jié)細(xì)胞存活，以及視神經(jīng)再生，尋求治療方法以及研究其機(jī)理，對于救治此類眼疾具有十分重要的理論和臨床應(yīng)用意義。
　　第一部分嗅鞘細(xì)胞對損傷節(jié)細(xì)胞的體外保護(hù)作用。嗅鞘細(xì)胞（olfactoryensheathingcells,OECs）移植是一種治療中樞神經(jīng)損傷并重建其功能的優(yōu)良方法。既往研究

2、將OECs移植入損傷的脊髓和視神經(jīng)，發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF）表達(dá)升高，但是沒有相關(guān)證據(jù)表明OECs直接通過分泌BDNF起到保護(hù)作用。為回答此問題，我們分為四方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。第一，建立了一種節(jié)細(xì)胞體外劃傷模型；第二，通過相差顯微鏡觀察了嗅鞘細(xì)胞條件培養(yǎng)基（olfactoryensheathingcell-conditionedmedium,OEC-CM,含OECs

3、分泌的各種因子）對損傷節(jié)細(xì)胞形態(tài)的影響。通過β-tubulinⅢ免疫熒光染色，觀察了OEC-CM對損傷后節(jié)細(xì)胞存活數(shù)量的影響。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測了OEC-CM對節(jié)細(xì)胞活性的影響；第三，通過western-blot方法檢測了OEC-CM濃縮液中的BDNF量；第四，通過BDNF中和性抗體中和了BDNF的作用，研究了抑制BDNF作用后，OEC-CM對損傷的節(jié)細(xì)胞是否還有保護(hù)作用。結(jié)果顯示：第一，虹膜刀劃傷培養(yǎng)的節(jié)細(xì)胞后，其突起受損回縮；第二，

4、OEC-CM在損傷區(qū)存活節(jié)細(xì)胞形態(tài)完整，突起較長，β-tubulinⅢ陽性的節(jié)細(xì)胞數(shù)量顯著高于普通培養(yǎng)基組（NM）。損傷后檢測的OD值在OEC-CM組高于NM組。第三，在OEC-CM濃縮液中檢測到含量較高的BDNF；第四，BDNF中和性抗體阻斷了OEC-CM對損傷節(jié)細(xì)胞存活的促進(jìn)作用。結(jié)論：OECs可以分泌保護(hù)性因子對損傷的節(jié)細(xì)胞起保護(hù)性作用，且在OECs分泌因子中，BDNF對損傷節(jié)細(xì)胞的保護(hù)起了非常重要的作用。
　　第二部分眼玻

5、璃體腔內(nèi)移植嗅鞘細(xì)胞對視神經(jīng)損傷后節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用。既往研究將OECs移植入損傷的視神經(jīng)眶側(cè)殘段，但OECs在殘段內(nèi)存活時(shí)間較短，因此OECs對節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用只能維持到7d。因此，我們將OECs植入眼玻璃體腔內(nèi)，研究OECs對視神經(jīng)損傷后節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用。研究選取24只SD大鼠，建立視神經(jīng)橫斷模型，并分為兩組：OECs移植組，對照培養(yǎng)基移植組（sham組）。分別在損傷后7d和14d計(jì)數(shù)存活的節(jié)細(xì)胞密度。損傷后7d和14d，OECs組存

6、活的節(jié)細(xì)胞密度高于sham組77％和126％，差異呈顯著性（p<0.05）。結(jié)論：植入玻璃體腔內(nèi)的OECs能在視神經(jīng)損傷后的較長時(shí)間內(nèi)對節(jié)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。
　　第三部分支鏈氨基酸（branched-chainaminoacid,BCAA）是含有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸，它包含亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸。據(jù)研究報(bào)道食用BCAA可以促進(jìn)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷的認(rèn)知功能及突觸傳遞效能的恢復(fù)。但是視神經(jīng)損傷后，BCAA能否促進(jìn)節(jié)細(xì)胞存活和軸突再生，且

7、這種作用的可能機(jī)理現(xiàn)在并不清楚。另外BCAA對視神經(jīng)損傷有何種副作用，現(xiàn)在仍不清楚。因此我們分為五方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。第一，采用視神經(jīng)橫斷模型檢驗(yàn)BCAA對節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用，將54只SD大鼠分為3組：BCAA組，Threonine組和saline組。分別在損傷后2d，7d和14d觀察節(jié)細(xì)胞的存活情況；第二，采用視神經(jīng)橫斷-坐骨神經(jīng)移植方法研究BCAA對視神經(jīng)再生的作用。將14只SD大鼠分為2組：BCAA組（8只）和saline組（6只）進(jìn)

8、行治療。損傷后25d進(jìn)行熒光金逆行性標(biāo)記。損傷后28d取視網(wǎng)膜進(jìn)行計(jì)數(shù)，取視神經(jīng)殘段及移植的坐骨神經(jīng)進(jìn)行冰凍切片、GAP43免疫熒光染色。第三，研究了外源性BCAA對mTOR信號的活化作用。磷酸化S6（p-S6）的量可以反映mTOR信號的活化狀態(tài)。將32只SD大鼠分為兩組：BCAA組（16只）和saline組（16只）進(jìn)行治療，分別在損傷后1d，3d，7d和14d取眼球進(jìn)行冰凍切片及p-S6和NeuN雙重免疫熒光染色，計(jì)算節(jié)細(xì)胞層p-S

9、6陽性細(xì)胞占NeuN陽性的節(jié)細(xì)胞的比率。第四，有研究發(fā)現(xiàn)BCAA對導(dǎo)致培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)改變，我們觀察研究了BCAA對視網(wǎng)膜中特殊的星形膠質(zhì)細(xì)胞（即muller細(xì)胞）形態(tài)的影響。將18只SD大鼠分為6組：正常視神經(jīng)組（normal），正常視神經(jīng)+saline處理組（normal+saline），正常視神經(jīng)+BCAA處理組（normal+BCAA），損傷視神經(jīng)組（injury），損傷視神經(jīng)+saline處理組（injury+salin

10、e），損傷視神經(jīng)+BCAA處理組（injury+BCAA）。處理或手術(shù)后7d取眼球進(jìn)行冰凍切片和GFAP免疫熒光染色，觀察GFAP陽性的muller細(xì)胞形態(tài)變化；第五，氧化損傷導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，抗氧化損傷對于中樞神經(jīng)元存活至關(guān)重要。我們將24只SD大鼠分為2組：BCAA組和saline組。分別在損傷后1d，3d，7d，14d通過定量PCR檢測抗氧化體系的調(diào)控分子PGC-1α以及抗氧化分子SOD1，SOD2，GpX1，catalase的表達(dá)

11、情況，研究BCAA對抗氧化體系的作用。結(jié)果表明：第一，相比saline處理組，BCAA可以促進(jìn)損傷后7d和14d存活的節(jié)細(xì)胞顯著性增加，而Threonine沒有此作用。第二，相比saline處理組，BCAA可以促進(jìn)視神經(jīng)再生以及視神經(jīng)殘段GAP-43陽性纖維增多。第三，相比saline處理組，BCAA促進(jìn)損傷后1d，3d，7dp-S6陽性的節(jié)細(xì)胞比率增多。第四，損傷會導(dǎo)致GFAP免疫熒光染色的細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生變化，但是BCAA不會影響GFA