高支鏈氨基酸血癥加重心肌缺血-再灌注損傷及其分解代謝研究.pdf

1、研究背景:
　　在過去的30年里全球糖尿病患者數(shù)量增加超過2倍,這使糖尿病成為所有國家面臨的具有挑戰(zhàn)性的重大公眾健康問題之一。國際糖尿病聯(lián)盟最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,“2013年全球糖尿病患病人數(shù)為3.82億;預計到2035年,全球糖尿病患者將達到5.92億,糖耐量異?；颊邽?.71億。此外,2013年全球共有510萬人死于糖尿病相關疾病(占總死亡人數(shù)的8.39％),糖尿病全球醫(yī)療費用達5480億美元(占全球醫(yī)療支出的11%)”。我國糖尿

2、病患病人數(shù)居全球首位。2013年我國糖尿病患者人數(shù)為1.14億;到2035年,中國的糖尿病患病人數(shù)將達到1.43億。故而,采取有效的措施防治糖尿病及其并發(fā)癥意義重大。
　　“糖尿病是冠心病的重要危險因素”。每年死亡的糖尿病患者中,大約2/3是由于心血管并發(fā)癥所致;糖尿病患者發(fā)生心肌梗死的風險增加3倍?；A研究也證實,糖尿病動物心肌易損性增加。然而,高糖“毒性”并不能完全解釋這一現(xiàn)象。系列臨床試驗發(fā)現(xiàn),強化降糖對于降低高?；颊咝难?/p>

3、事件的發(fā)生并無益處。據(jù)此,“治療2型糖尿病的理念已經(jīng)從單純降糖向控制可導致心血管疾病的多重危險因素轉變”。
　　2型糖尿病患者不僅糖脂代謝異常,蛋白質代謝也存在問題。然而,作為能量物質之一的蛋白質,尤其是支鏈氨基酸(branched chain amino acids,BCAA)在心肌損傷中的作用卻知之甚少。臨床數(shù)據(jù)顯示,糖尿病患者血漿中BCAA含量顯著增加,BCAA參與肥胖癥患者胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展。該結果提示我們,BCAA可能在

4、疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色,絕非是伴隨現(xiàn)象。BCAA致使2型糖尿病患病風險增加5倍;血漿中BCAA及其代謝產(chǎn)物與胰島素抵抗緊密相關。數(shù)據(jù)還顯示,BCAA及其代謝產(chǎn)物預測糖尿病發(fā)病。且獨立于胰島素抵抗和糖尿病,BCAA與冠心病嚴重程度緊密相關。然而,高BCAA血癥是否具有直接的心臟損傷作用尚不清楚。
　　脂聯(lián)素具有調(diào)節(jié)糖類、脂質代謝及心血管保護作用。2013年3月發(fā)表在Diabetes雜志上的數(shù)據(jù)顯示,脂聯(lián)素治療2周可以改善骨骼

5、肌BCAA水平。眾多研究還顯示,高血漿脂聯(lián)素人群患2型糖尿病的危險性較低,糖尿病患者血漿脂聯(lián)素含量顯著減少。然而,低脂聯(lián)素血癥是否與糖尿病BCAA積聚有關;且脂聯(lián)素通過何種機制影響B(tài)CAA分解代謝尚未見報道。
　　據(jù)此,我們的科學問題是:
　　1.獨立于糖尿病其他危險因素,高BCAA血癥是否加重心肌損傷,其機制是什么?
　　2.糖尿病患者BCAA升高的原因和機制是什么?
　　研究目的:
　　1.明確高BCA

6、A血癥是否加重心肌缺血/再灌注損傷,其機制是否與氧化應激有關。
　　2.明確低脂聯(lián)素血癥是否參與糖尿病BCAA升高,并闡明其介導糖尿病BCAA分解代謝障礙的機制。
　　研究方法:
　　1.高BCAA血癥通過誘發(fā)氧化應激加重小鼠心肌缺血/再灌注損傷
　　1.1.制備心肌缺血/再灌注損傷模型:
　　用6-0絲線結扎小鼠左冠狀動脈并打一活結造成心肌缺血,缺血40 mins后打開活結。分別在再灌注3 hs(檢測凋亡

7、、ROS及蛋白含量)以及灌注24 hs(檢測心肌梗死面積、心功能及線粒體形態(tài))。Sham組采用同樣的手術方法,但不結扎小鼠左冠狀動脈。
　　1.2.小動物超聲檢測小鼠心臟功能。
　　1.3.伊文氏藍/TTC雙染法檢測小鼠心肌梗死面積。
　　1.4.酶分析試劑盒檢測血漿中BCAA含量。
　　1.5.透射電鏡觀察線粒體形態(tài)。
　　1.6.TUNEL染色及Caspase-3活性作為檢測凋亡的指標。
　　1.

8、7.DHE染色檢測ROS含量。
　　1.8.Western blot法檢測MnSOD蛋白表達。
　　2.APN-AMPK-PP2Cm信號通路受損是糖尿病支鏈氨基酸分解代謝障礙的機制
　　2.1.制備2型糖尿病小鼠模型:
　　60% HD喂養(yǎng)雄性C57BL/6小鼠6周,第2周腹腔注射低劑量STZ。STZ誘導第4周(HD喂養(yǎng)第6周)檢測小鼠隨機血糖≥200 mg/dL為2型糖尿病造模成功指標。
　　2.2.肝臟

9、細胞siRNA(AMPKα1 siRNA,AMPKα2 siRNA)轉染:
　　制備siRNA-siRNA-mate復合物并將其逐滴滴加到每孔細胞中,輕輕混勻。將細胞置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。孵育6 h后用含10%胎牛血清的DMEM孵育;48 h后收集細胞,Western blot法檢測轉染效率。
　　2.3.HPLC檢測血漿及培養(yǎng)細胞上清中BCKA含量。
　　2.4.酶分析法試劑盒檢測血漿中BCAA含量。

10、
　　2.5.Western blot法檢測AMPKα、AMPKα1、AMPKα2、P-AMPKα、PP2Cm、P-BCKD E1α、BCKD E1α蛋白含量。
　　2.6.RT-PCR法檢測PP2Cm和脂聯(lián)素mRNA含量。
　　2.7.IPGTT檢測葡萄糖耐量。
　　2.8.ELISA法檢測血漿中脂聯(lián)素含量。
　　2.9.檢驗科檢測血漿胰島素含量。
　　2.10.檢驗科檢測甘油三脂水平。
　　

11、研究結果:
　　1.高BCAA血癥通過誘發(fā)氧化應激加重小鼠心肌缺血/再灌注損傷
　　1.1.高BCAA血癥小鼠心肌缺血/再灌注損傷增加
　　與WT小鼠比較,高BCAA血癥小鼠心肌缺血/再灌注損傷加重。表現(xiàn)為心肌梗死面積增加,心功能惡化。
　　1.2.高BCAA血癥小鼠心肌缺血/再灌注誘導的細胞凋亡增加
　　與WT小鼠比較,高BCAA血癥小鼠心肌組織缺血/再灌注誘導的TUNEL陽性顯著增加,Caspas-3活

12、性也顯著增加。
　　1.3.高BCAA血癥小鼠心肌缺血/再灌注誘導的氧化應激加劇
　　與WT小鼠比較,高BCAA血癥小鼠心肌缺血/再灌注誘導的ROS生成增加,MnSOD代償性增加被抑制;SOD類似物(MnTBAP)治療,減少ROS含量,改善心肌線粒體損傷。
　　1.4.SOD類似物治療改善高BCAA血癥小鼠心肌缺血/再灌注損傷
　　再灌注前10 min給予SOD類似物(MnTBAP)治療,高BCAA血癥小鼠心臟功

13、能改善、心肌梗死面積減少、心肌細胞凋亡減少。
　　2.APN–AMPK-PP2Cm信號通路受損是糖尿病支鏈氨基酸分解代謝障礙的機制
　　2.1.ob/ob及誘導的2型糖尿病小鼠肝臟組織PP2Cm mRNA和蛋白水平顯著減少
　　與WT小鼠比較,ob/ob及誘導的2型糖尿病小鼠血漿中BCAA和BCKA含量顯著增加;肝臟中P-BCKD E1α水平顯著增加;糖尿病小鼠肝臟中PP2Cm mRNA水平及蛋白豐度顯著下調(diào)。

14、　　2.2.脂聯(lián)素敲除小鼠肝臟中PP2Cm含量及BCKD活性顯著下降,BCKA含量顯著升高
　　與HD喂養(yǎng)的WT小鼠相比,HD喂養(yǎng)的APN-/-小鼠血漿中BCAA和BCKA含量顯著增加。重要的是,HD喂養(yǎng)的APN-/-小鼠肝臟中BCKD活性及PP2Cm含量顯著下調(diào)。給予外源性脂聯(lián)素治療HD喂養(yǎng)的APN-/-小鼠3天,結果發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素治療顯著逆轉血漿BCAA和BCKA水平,同時增加肝臟中BCKD活性及PP2Cm蛋白水平。
　　

15、2.3.脂聯(lián)素治療顯著上調(diào)糖尿病小鼠肝臟BCKD活性及PP2Cm含量,降低BCKA水平;但是 PP2Cm部分介導了脂聯(lián)素激活BCKD活性的作用
　　脂聯(lián)素治療3天顯著減少BCAA和BCKA水平,增加BCKD活性。此外,脂聯(lián)素治療顯著上調(diào)糖尿病小鼠肝臟中PP2Cm mRNA水平和蛋白豐度。但是,PP2Cm-/-小鼠部分保留了脂聯(lián)素激活BCKD的作用。也就是說,脂聯(lián)素治療的PP2Cm-/-小鼠血漿中BCAA及BCKA含量、肝臟組織中P

16、-BCKD水平均顯著高于脂聯(lián)素治療的ob/ob及 WT小鼠。
　　2.4.脂聯(lián)素依賴AMPK促進BCKA分解代謝
　　AMPK激動劑AICAR顯著減少糖尿病小鼠血漿及培養(yǎng)的肝臟細胞上清中BCAA及BCKA含量,增加糖尿病小鼠肝臟組織和細胞中BCKD活性,同時還上調(diào)PP2Cm蛋白表達;AMPK抑制劑CC完全阻斷了脂聯(lián)素促進BCKA氧化脫羧分解的作用。
　　2.5.AMPKα2介導脂聯(lián)素調(diào)節(jié)BCKA分解代謝
　　與對

17、照及AMPKα1 siRNA組比較,轉染AMPKα2 siRNA及高BCKA孵育的肝臟細胞中PP2Cm蛋白含量和BCKD活性顯著下降,培養(yǎng)上清中BCKA含量增加。AMPKα2 siRNA也完全阻斷了脂聯(lián)素上調(diào) PP2Cm表達、BCKD活性及促進BCAA分解的作用。
　　研究結論:
　　1.本課題證實了高BCAA血癥加重小鼠心肌缺血/再灌注損傷。其機制是高BCAA抑制缺血/再灌注誘導的MnSOD代償性增加,ROS清除被抑制,心