支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶1在乳腺癌中的表達(dá)及其影響乳腺癌增殖的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及意義：
　　乳腺癌是乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生癌變的惡性腫瘤，在世界上嚴(yán)重威脅人類健康。在發(fā)達(dá)國家及地區(qū)，患乳腺癌的概率及其死亡率均居女性惡性腫瘤之首。近年來乳腺癌治療方式不斷進(jìn)展，由手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療、分子生物靶向治療和中醫(yī)藥治療結(jié)合的綜合治療已成為當(dāng)前治療乳腺癌的主流模式，乳腺癌的治療療效不斷提高，已成為預(yù)后較好的實(shí)體腫瘤之一。但是，目前全球乳腺癌的發(fā)病率每年都在增加，在中國，乳腺癌的發(fā)病率在女性疾病中占據(jù)第一位，并

2、且有年輕化的趨勢，成為危害女性身心健康的頭號殺手。因此防治乳腺癌具有重要的意義。近年來，在乳腺癌分子代謝重編方面的研究有了一些進(jìn)展。例如，在乳腺癌中，丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK1)能通過調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)因子1α來調(diào)節(jié)乳腺癌的增殖。
　　支鏈氨基酸(BCAAs)，主要有亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸，是重要的營養(yǎng)信號，對機(jī)體活動有直接和間接的影響。血漿中BCAAs水平和心血管疾病的發(fā)生有關(guān)，并且血清中高水平BCAAs和人類未來糖尿病有極大的聯(lián)

3、系，這可能是因?yàn)锽CAAs能影響胰島素耐受性。BCAAs分解代謝缺陷也會引起疾病。例如，在血腦屏障期受損的氨基酸運(yùn)輸能降低腦支鏈氨基酸的正常水平，并且誘導(dǎo)支鏈氨基酸的代謝缺陷。另外，支鏈氨基酸分解代謝缺陷是心力衰竭的代謝標(biāo)志，能夠促進(jìn)心力衰竭。支鏈氨基酸還參與癌癥的發(fā)生及發(fā)展。血漿中，支鏈氨基酸的高水平增加胰腺癌發(fā)生的兩倍風(fēng)險。支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶1(BCAT1)能夠激發(fā)支鏈氨基酸的分解代謝，在攜帶異檸檬酸脫氫酶1的人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，BCA

4、T1能夠通過氨基酸代謝促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。在非小細(xì)胞肺癌中，BCAT1和BCAT2的損失能夠破壞非小細(xì)胞肺癌的形成。BCAT1可能通過調(diào)控線粒體的合成及功能影響乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，線粒體的生物合成和功能與許多因子有關(guān)，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)、呼吸因子（NRF-1）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶以及活性氧(ROS)。然而，支鏈氨基酸分解代謝在乳腺癌血液及組織中

5、的作用仍未知。
　　本次研究支鏈氨基酸代謝在人類乳腺癌中的潛在作用。本研究共分為四個部分，第一部分，收集山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院2010到2015年共計(jì)200例乳腺癌患者及100例正常人。應(yīng)用LC-MS、實(shí)時定量PCR檢測支鏈氨基酸及核心酶在腫瘤患者血漿及腫瘤組織中的表達(dá)。第二部分，采用shRNA和siRNA技術(shù)干擾人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/T47D中BCAT1的表達(dá)，觀察干擾BCAT1對MCF-7/T47D細(xì)胞增殖、克隆形成的影響。

6、第三部分，采用實(shí)時定量PCR、分光光度法、mitoSOX染色法等檢測線粒體生物合成的調(diào)節(jié)因子表達(dá)、檸檬酸合酶活性、細(xì)胞ATP水平、線粒體ROS及抗氧化劑表達(dá)，來探究BCAT1對線粒體生物合成及功能的影響。第四部分，通過檢測mTOR的蛋白表達(dá)、線粒體DNA含量、線粒體ROS，探究BCAT1影響乳腺癌細(xì)胞增殖速度及克隆能力的分子機(jī)制。
　　第一部分：支鏈氨基酸及核心酶在乳腺癌中的表達(dá)
　　研究目的：
　　1、探究支鏈氨基酸

7、在乳腺癌病人血液及癌組織中的水平。
　　2、探究影響支鏈氨基酸代謝的核心酶表達(dá)。
　　研究方法：
　　1.選取在2010到2015年于山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的200例乳腺癌病人以及100例健康志愿者。收集其血漿、腫瘤組織和癌旁無腫瘤組織，-80℃保存組織標(biāo)本以備檢測;
　　2.采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法測定支鏈氨基酸在乳腺癌患者及健康志愿者中的血漿水平圖;
　　3.檢測乳腺癌患者和正常人的血漿中、乳

8、腺癌患者腫瘤組織和癌旁無腫瘤組織標(biāo)本中亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的表達(dá);
　　4.采用實(shí)時定量PCR檢測支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶1在乳腺癌患者及健康志愿者中的表達(dá);
　　研究結(jié)果：
　　1.與正常捐贈者相比，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸在乳腺癌患者血漿中的表達(dá)明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);
　　2.乳腺癌患者腫瘤組織中的亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸水平顯著高于癌旁非腫瘤組織(p＜0.05);
　　3.乳腺癌患

9、者腫瘤組織中的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶1表達(dá)顯著高于癌旁非腫瘤組織(p＜0.05);
　　結(jié)論：
　　總的來說，支鏈氨基酸水平及支鏈氨基酸降解酶在乳腺癌患者中的表達(dá)水平顯著升高(p＜0.05)，這表明在乳腺癌組織中，支鏈氨基酸代謝被激活，從而有助于制定乳腺癌的治療方案及預(yù)后。
　　第二部分：干擾BCAT1表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖及克隆能力的影響
　　研究目的：
　　1.探究BCAT1過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖及克隆形成的影

10、響;
　　2.探究干擾BCAT1表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖及克隆形成的影響;
　　研究方法：
　　1.將購買好的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒到轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞中，空白表達(dá)的質(zhì)粒作為對照組，構(gòu)建BCAT1沉默組（shBCAT1組）、對照組（shCtrl組）、BCAT1過表達(dá)組及對照組（Ctrl組），采用蛋白印記驗(yàn)證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功;
　　2.采用CCK-8比色法探究BCAT1過表達(dá)和沉默對人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D細(xì)胞增殖能力的影響。<

11、br>　　3.采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)探索BCAT1過表達(dá)和沉默對MCF-7和T47D細(xì)胞系的細(xì)胞克隆形成能力的影響;
　　研究結(jié)果：
　　1.蛋白印跡顯示，轉(zhuǎn)染72小時后，與對照組相比，shBCAT1組人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D中BCAT1的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，而BCAT1組人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D中BCAT1的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)。
　　2.CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)顯示，與

12、shCtrl組相比，從24h開始，shBCAT1組增殖活性開始明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，與shCtrl組相比，sh BCAT1組的克隆細(xì)胞數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)顯示，與Ctrl組相比，從24h開始，BCAT1組增殖活性開始明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示，與Ctrl組相比， BCAT1組的克隆細(xì)胞數(shù)顯著增加，差

13、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.病毒及質(zhì)粒感染能夠有效上調(diào)和下調(diào)BCAT1的表達(dá);
　　2.BCAT1過表達(dá)能夠提高乳腺癌細(xì)胞的增殖及克隆形成，BCAT1沉默能夠降低乳腺癌細(xì)胞的增殖及克隆形成;
　　第三部分：BCAT1調(diào)節(jié)線粒體的生物合成及功能
　　研究目的：
　　1.探究BCAT1在調(diào)節(jié)線粒體生物合成中的作用
　　2.探究BCAT1對線粒體生物功能的影響
　　研

14、究方法：
　　1.通過測定人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D中線粒體DNA含量，探究BCAT1能否調(diào)節(jié)線粒體生物合成及功能;
　　2.采用實(shí)時定量PCR檢測Ctrl組、BCAT1組、shCtrl組、shBCAT1組中線粒體生物合成關(guān)鍵基因-過氧化酶體增生物激活受體、核呼吸因子1、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A、β-F1型ATP合成酶-的mRNA表達(dá);
　　3.采用分光光度法檢測shCtrl組、shBCAT1組人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7

15、和T47D中的檸檬酸合酶活性;
　　4.采用mitoSOX染色檢測shCtrl組、shBCAT1組人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D中線粒體ROS;
　　5.采用實(shí)時定量PCR檢測shCtrl組、shBCAT1組中超氧化物歧化酶1，超氧化物歧化酶2，過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶抗的mRNA表達(dá);
　　研究結(jié)果：
　　1.BCAT1沉默降低MCF-7/T47D細(xì)胞系中的線粒體DNA含量，而BCAT1過表達(dá)增加了M

16、CF-7/T47D細(xì)胞系中的線粒體DNA含量(p＜0.05);
　　2.BCAT1沉默降低過氧化酶體增生物激活受體、核呼吸因了1、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A、β-F1型ATP合成酶的mRNA水平，BCAT1過表達(dá)導(dǎo)致相反的結(jié)果;
　　3.BCAT1沉默降低檸檬酸合酶活性水平，抑制超氧化物歧化酶1，超氧化物歧化酶2，過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶mRNA水平，并且誘導(dǎo)線粒體ROS的增加;
　　結(jié)論：
　　1.BCAT1能夠通

17、過增加線粒體數(shù)目、提高影響線粒體生物合成的調(diào)節(jié)因子來影響線粒體的生物合成;
　　2.BCAT1能通過提高檸檬酸合酶活性、抗氧化劑-超氧化物歧化酶1，超氧化物歧化酶2，過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶-的mRNA水平以及抑制線粒體ROS來影響線粒體功能;
　　第四部分：BCAT1對乳腺癌細(xì)胞系mTOR的影響
　　研究目的：
　　1.探究BCAT1對乳腺癌組織中關(guān)鍵蛋白AMPK和mTOR磷酸化水平的影響。
　　2

18、.探究受BCAT1影響的mTOR對線粒體功能及乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。
　　研究方法：
　　1.采用蛋白印跡法檢測shCtrl組、shBCAT1組ρ-AMPK、AMPK、SIRT1的蛋白表達(dá)，并使用蛋白印跡法測定shCtrl組、shBCAT1組及Ctrl組、BCAT1組ρ-mTOR、rTOR、ρ-S6K1和S6K1的蛋白表達(dá);
　　2.使用雷帕霉素抑制乳腺癌細(xì)胞系中的mTOR，并采用實(shí)時定量PCR檢測BCAT1過表達(dá)乳腺

19、癌細(xì)胞系中PGC1α、NRF-1、Tfam、β-F1-ATPase、SOD1、SOD2、過氧化氫酶和Gpx1的mRNA水平;
　　3.測定 Ctrl+Vechicle組、 BCAT1+Vechicle組、 Ctrl+Rapamycin組、BCAT1+Rapamycin組乳腺癌細(xì)胞系中的線粒體DNA含量、線粒體ROS、細(xì)胞克隆數(shù)和細(xì)胞增殖情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.BCAT1沉默不會影響AMPK和SIRT1的蛋白表達(dá)

20、、mTOR信號，BCAT1過表達(dá)激活mTOR信號;
　　2.雷帕霉素能抑制mTOR信號，而mTOR通路被抑制的人乳腺癌細(xì)胞中，BCAT1過表達(dá)不會影響PGC1α、NRF-1、Tfam、β-F1-ATP酶、SOD1、SOD2、過氧化氫酶和Gpx1的mRMA水平;
　　3.mTOR通路被抑制能夠阻止BCAT1對線粒體生物合成及線粒體ROS的影響;
　　4.mTOR通路被抑制能夠減弱BCAT1對乳腺癌細(xì)胞增殖速度及克隆形成能