蘇云金芽孢桿菌中抗生素Zwittermicin A的分離純化與檢測.pdf

1、ZwittermicinA是由蠟狀芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的一種新型的廣譜抗生素，是已知唯一的線性氨基多元醇類抗生素，對卵菌、藻類、原生生物和多種G+和G-細(xì)菌及部分植物病原真菌均表現(xiàn)出一定的抑菌活性。此外，該抗生素還能與蘇云金芽孢桿菌Bt晶體蛋白協(xié)同作用，提高其殺蟲活性，減少Bt制劑用量，降低害蟲抗藥性的產(chǎn)生。ZwittermicinA作為一種新型的農(nóng)用抗生素，具有很高的研究價值和應(yīng)用價值，但目前由于缺少標(biāo)準(zhǔn)品，關(guān)于Zwitter

2、micinA的很多研究都難以進(jìn)行。
　　 本研究主要圍繞蘇云金芽孢桿菌HD-1中ZwittermicinA的分離純化與檢測方法的建立進(jìn)行初步研究。首先，對蘇云金芽孢桿菌HD-1擴(kuò)大生產(chǎn)的發(fā)酵工藝進(jìn)行了研究，優(yōu)化了發(fā)酵條件和ZwittermicinA粗提液制備流程，為ZwittermicinA的分離純化奠定了基礎(chǔ)。發(fā)酵條件為：采用氣升式發(fā)酵罐培養(yǎng)，選擇大豆分離蛋白培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30℃，發(fā)酵時間為36h，培養(yǎng)基初始p

3、H為7.5。其次，選用非極性大孔樹脂LX-68M初步純化。大孔樹脂純化條件為：選擇非極性大孔樹脂LX-68M，靜態(tài)吸附3h，去離子水洗脫6BV，收集后減壓濃縮，回收率為87％。再次，用硅膠柱層析進(jìn)行二次純化，根據(jù)ZwittermicinA與茚三酮的顯色反應(yīng)，以及草生歐文氏桿菌對其敏感等特點(diǎn)，進(jìn)行活性物質(zhì)的跟蹤監(jiān)測并收集。硅膠柱層析純化條件：選擇100～140目硅膠，濕法裝柱，干法上樣，柱床高度為40cm，上樣體積為5mL，洗脫劑為乙酸乙

4、酯：甲醇=70:30(V/V)，流速0.5mL/min。最后，對純化后樣品用分析型HPLC-MS進(jìn)行純度分析，ESI-MS進(jìn)行分子量鑒定，最后得到純度為89％的ZwittermicinA精制品約90mg(1L發(fā)酵液)。從而建立了一種效能高，成本低，可重復(fù)性強(qiáng)的ZwittermicinA精制品回收工藝，為ZwittermicinA標(biāo)準(zhǔn)品的半制備提供了前提條件。
　　 本研究建立了3種ZwA含量的檢測方法。首先是相對含量檢測法，Zw

5、A含量與抑菌圈的直徑存在良好的線性關(guān)系，根據(jù)抑菌圈直徑大小來計(jì)算ZwA相對含量。其次是HPLC檢測方法，最佳色譜條件為反相C18分析柱，流動相為水：甲醇=85:15(V/V)，紫外檢測器，檢測波長210nm，流速為0.5mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫35℃，保留時間為10.0～10.5min，檢測出ZwittermicinA精制品的純度為89％。最后是以腐胺為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了茚三酮顯色法測ZwittermicinA含量。其中，HPLC