離心去脂對(duì)豬孤雌激活胚胎的影響及機(jī)制研究.pdf

1、脂滴一方面作為卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育過程中重要的能源物質(zhì)，對(duì)卵母細(xì)胞成熟和胚胎的發(fā)育至關(guān)重要;另一方面，由于豬卵母細(xì)胞和早期胚胎中脂滴含量非常豐富，對(duì)冷凍敏感性極高，因此，豬的卵母細(xì)胞和胚胎的冷凍效率一直非常低。研究表明通過機(jī)械的離心去脂雖然可以顯著提高豬卵母細(xì)胞和胚胎的冷凍效率，但是，部分研究表明去脂會(huì)影響胚胎發(fā)育的效率及胚胎的質(zhì)量。不同的研究結(jié)果也表明離心去脂對(duì)豬胚胎的發(fā)育沒有影響。關(guān)于這方面的研究多是通過簡(jiǎn)單的觀察統(tǒng)計(jì)進(jìn)行的，而且

2、數(shù)量很少。因此本研究通過對(duì)離心去脂胚胎發(fā)育過程中脂滴、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器進(jìn)行觀察分析，結(jié)合細(xì)胞內(nèi)能量代謝水平，來系統(tǒng)的揭示離心去脂對(duì)豬孤雌激活胚胎發(fā)育的影響及機(jī)制。選擇MⅡ期卵母細(xì)胞先部分消化透明帶，然后再進(jìn)行高速離心，之后徹底去除透明帶，孤雌激活后在WOWs培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)到第6天。
　　1、離心去脂顯著降低豬孤雌激活胚胎發(fā)育潛能
　　在胚胎體外培養(yǎng)的24h、36h和144小時(shí)，分別統(tǒng)計(jì)去脂組和對(duì)照組2-細(xì)胞、4-細(xì)胞和

3、囊胚的發(fā)育效率，通過Hoechst33342染色檢測(cè)第6天的囊胚細(xì)胞數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)去脂組和對(duì)照組的2-細(xì)胞率和4-細(xì)胞率都沒有差異（95.83±2.25％ vs.97.44±0.67％;79.17±4.47％ vs.84.62±1.19％）。去脂組囊胚率顯著低于對(duì)照組(21.67±3.78％ vs.49.36±1.77％)，兩組細(xì)胞數(shù)沒有顯著差異(37.92 vs.41.88)。
　　2、離心去脂對(duì)豬孤雌激活胚胎發(fā)育過程中脂滴的影響

4、
　　收集對(duì)照組和去脂組MⅡ期卵母細(xì)胞和孤雌激活后12h、24h、36h和144h的1-細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞和囊胚，PFA固定后用油紅O染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)去脂組的MⅡ期卵母細(xì)胞中，脂滴數(shù)量很少，剩余的大多為小脂滴，且都被極化到了卵母細(xì)胞的一邊。在去脂組早期胚胎中（1-到4-細(xì)胞），部分脂滴形成了一個(gè)環(huán)狀的結(jié)果圍繞細(xì)胞核分布，其余分布在細(xì)胞外周。當(dāng)胚胎發(fā)育到囊胚期時(shí)，無論對(duì)照組還是去脂組，脂滴都均勻分布在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞。去脂組

5、中的脂滴含量從MⅡ卵母細(xì)胞到囊胚階段保持不變，但是脂滴的體積在逐漸減小。
　　3、離心去脂對(duì)豬孤雌激活胚胎發(fā)育過程中線粒體的影響
　　收集對(duì)照組和去脂組MⅡ期卵母細(xì)胞和孤雌激活后的1-細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞和囊胚，用MitoTracker Red CMXRos(MTR)染色后PFA固定觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)離心過程中少量線粒體會(huì)隨脂滴被離出細(xì)胞外，剩余線粒體被極化到卵母細(xì)胞的一邊。去脂胚胎發(fā)育過程中線粒體的分布會(huì)發(fā)生變化且與對(duì)照組

6、分布相同。在1-到4-細(xì)胞期間，線粒體主要分布在各卵裂球的外周。但是到囊胚時(shí)期時(shí)，線粒體均勻的分布在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞。利用熒光定量PCR檢測(cè)mtDNA拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn)，從MⅡ卵母細(xì)胞到囊胚期的無論哪個(gè)時(shí)期，對(duì)照組和去脂組胚胎的mtDNA拷貝數(shù)都沒有顯著差異。而且在對(duì)照組和去脂組中mtDNA拷貝數(shù)都是從MⅡ卵母細(xì)胞到4-細(xì)胞逐漸降低，隨后與囊胚期保持一致。
　　4、離心去脂對(duì)豬孤雌激活胚胎發(fā)育過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響
　　收集對(duì)照組和

7、去脂組MⅡ期卵母細(xì)胞和孤雌激活后1-細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞和囊胚，用ER-TrackerTM Green染色后觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)離心去脂主要影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在MⅡ期卵母細(xì)胞中的分布形式。在對(duì)照組MⅡ卵母細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)簇被分散分布在整個(gè)胞質(zhì)中，離心后被極化到細(xì)胞的一邊。在胚胎發(fā)育過程中對(duì)照組和去脂組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布相似。1-到4-細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)簇部分分布在卵裂球的皮質(zhì)層，其余的主要分布在細(xì)胞核的周圍，形成一個(gè)明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光密度環(huán)。在對(duì)照組和去脂組的囊

8、胚中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)簇被均勻分布在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞，而且，可以清楚的看到在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞中，都會(huì)形成明顯的圍核熒光密度環(huán)。通過細(xì)胞骨架抑制劑的添加實(shí)驗(yàn)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在去脂MⅡ卵母細(xì)胞到1-細(xì)胞期間的恢復(fù)主要是微絲介導(dǎo)的。
　　5、離心去脂對(duì)豬孤雌激活胚胎發(fā)育過程中ATP的影響
　　收集孤雌激活后的1-細(xì)胞、4-細(xì)胞和囊胚，利用熒光素酶ATP檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)胚胎內(nèi)ATP的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有在1-細(xì)胞時(shí)期，去脂組的ATP含量顯著低于