小鼠孤雌單倍體胚胎干細胞多能性與功能的研究.pdf

1、大多數(shù)生物包括人在內(nèi)都是二倍體，即有兩套染色體組，一套來源于父方，一套來源于母方。然而，對于基因研究來說，二倍體是巨大的困難，因為人們很難確定生物的某一性狀是由哪一套染色體決定的，隱性基因表型難以在雜合中體現(xiàn)出來。而對于單倍體細胞，如白色鏈球菌、酵母等是遺傳學(xué)研究的重要模型。在自然狀態(tài)下對于哺乳動物而言，只存在結(jié)構(gòu)和功能均已特化的單倍體配子，如卵子和精子。然而，卵子和精子在體外一般不能長期進行培養(yǎng)和擴增，因此難以對其進行基因方面的操作。

2、在體外能建立哺乳動物的單倍體干細胞系，將有利于促進哺乳動物發(fā)育、遺傳和進化等相關(guān)生命科學(xué)研究。研究人員已經(jīng)建立青鱒魚的單倍體胚胎干細胞，它們只含有一套染色體組。這些新的單倍體干細胞能夠用于快速地分析哺乳動物發(fā)育方面的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。能用于正反向遺傳篩選基因，能建立產(chǎn)生純合子基因突變文庫。2011年首次建立了哺乳動物孤雌單倍體胚胎干細胞系，這極大推動基因研究的進展。2012年我們研究組和李勁松研究組同時建立了孤雄單倍體胚胎干細胞系，證明了這

3、些細胞保留一定的雄性印記，功能試驗進一步驗證這些細胞能夠代替精子注入卵母細胞后可以產(chǎn)生健康的小鼠。
　　為了探討孤雌單倍體是否具有像孤雄單倍體替代精子一樣替代卵基因組支持胚胎發(fā)育。本實驗首次探討了小鼠孤雌單倍體胚胎干細胞多能性及其功能。利用孤雌激活的方法獲得孤雌單倍體細胞系，通過流式細胞分選技術(shù)能夠很好維持其單倍性。核型分析和CGH雜交技術(shù)建立單倍體干細胞系能很好的保持基因組穩(wěn)定性，染色體條數(shù)呈單倍性，基因拷貝數(shù)穩(wěn)定。利用Pigg

4、yBac過表達技術(shù)，Cas9技術(shù)分別建立GFP、RFP等穩(wěn)定過表達和基因敲除孤雌單倍體胚胎干細胞系，這些細胞系能長期穩(wěn)定傳代。
　　建立的孤雌單倍體胚胎干細胞具有多能性。免疫熒光染色和RT-PCR分析顯示孤雌單倍體表達Oct4、Nanog、SOX2、Klf4、SSEA1等多能性Marker。全基因組表達譜分析建立小鼠孤雌單倍體基因表達模式相比較于MEF更接近二倍體ES?；チ鰧嶒烌炞C小鼠孤雌單倍體能形成三胚層分化的畸胎瘤，二倍體嵌