流感泰得及其修飾物的制備與質(zhì)控方法的研究.pdf

1、流感泰得(Flutide,序列5'-CCTTGTTTCTACT-3’)是本室篩選出的作用于流感病毒基因組RNA5’非編碼區(qū)的新結(jié)構(gòu)、新靶點(diǎn)的抗流感病毒硫代修飾反義寡核苷酸,體內(nèi)外藥效學(xué)研究證明其具有較好的抗病毒活性。作為臨床前研究藥物,流感泰得的大規(guī)模制備及質(zhì)量控制是新藥研發(fā)中必不可少的技術(shù)環(huán)節(jié)。針對目前國內(nèi)核酸藥物制備規(guī)模小的問題和進(jìn)一步提高核酸藥物靶向性和膜透過性的目的開展了本課題的研究。
　　一、流感泰得質(zhì)規(guī)?；苽浼百|(zhì)量控

2、制方法的建立。
　　本實(shí)驗(yàn)將寡核苷酸的制備放大到中試規(guī)模,采用經(jīng)典的亞磷酰胺偶聯(lián)法合成硫代寡核苷酸藥物流感泰得,每個合成循環(huán)含四步反應(yīng):脫4,4-二甲氧基三苯甲基(DMT)、偶聯(lián)、封閉和硫代。合成粗品經(jīng)制備色譜純化,超濾脫鹽后凍干分裝。合成規(guī)模達(dá)到30mmol。
　　為了對Flutide進(jìn)行質(zhì)量控制,建立了離子對反相高效液相色譜(IP-RP-LC)質(zhì)控方法,并將其與其他兩種常用方法,離子交換高效液相色譜(IEC)和毛細(xì)管電泳

3、(CGE)法對Flutide中常見有關(guān)物質(zhì)的分析進(jìn)行比較。合成了Flutide及其單核苷酸縮短序列5’n-1、3’n-1和單氧代序列5’(P=O)1,將它們作為已知雜質(zhì),在IP-RP-LC上進(jìn)行分離條件的優(yōu)化,使用的分析柱為XTerra MS C18柱(250mm×4.6 mm,3.5μm);流動相A為142mM HFIP-36mM TEA-10％甲醇(v:v),流動相B為甲醇;梯度洗脫;檢測波長為260nm。結(jié)果表明,在該條件下,Fl

4、utide能同時(shí)與這幾種雜質(zhì)進(jìn)行分離,其中與縮短序列5’n-1和3’n-1可實(shí)現(xiàn)基線分離,而與5’(P=O)1之間的分離度也能達(dá)到0.94,解決了其他分析方法(IEC和CGE等)無法同時(shí)分離單核苷酸縮短雜質(zhì)與單氧代雜質(zhì)的問題。該研究采用建立的IP-RP-LC方法已成功應(yīng)用于Flutide粗品和純品中各類雜質(zhì)的分析和鑒定,證明該方法適用于硫代寡核苷酸類化合物的質(zhì)量控制。
　　二、流感泰得含量測定及方法學(xué)考察。
　　以高純度的F

5、lutide為標(biāo)準(zhǔn)品,采用離子對反相色譜法對Flutide的含量測定。主峰與最近的雜質(zhì)峰的分離度 R=0.94;含量測定重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果:峰面積RSD=1.59%,三個濃度樣品各重復(fù)測定三次獲得精密度結(jié)果,RSD分別為0.67%,1.0%,0.56%。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:y=26882x-71957 r=0.9999。含量測定范圍為20~1200μg/ml。
　　三、流感泰得及其有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)確證。
　　由于Flutide的

6、結(jié)構(gòu)為硫代修飾的寡核苷酸,其分子與小分子化合物性質(zhì)差別較大,因此一些鑒定小分子結(jié)構(gòu)常用的手段用于寡核苷酸類藥物的結(jié)構(gòu)分析時(shí),結(jié)果可能僅能提供部分參考,但無法對其所有基團(tuán)一一進(jìn)行確認(rèn),因此綜合考慮實(shí)際情況和參考文獻(xiàn)資料,采用紫外光譜、紅外光譜、各類質(zhì)譜、核磁共振譜、原子吸收光譜法等,分別對首次中試制備的樣品和工藝穩(wěn)定后制備得到的一批樣品及對照品的特征基團(tuán)、分子量、序列、等進(jìn)行分析和推測,確認(rèn)其化學(xué)結(jié)構(gòu)與理論結(jié)構(gòu)完全一致。此外,利用IP-R

7、P-HPLC法良好的分離能力,對Flutide粗品和純品的各雜質(zhì)分別進(jìn)行了手動收集,經(jīng)電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)鑒定,對各個雜質(zhì)做了成分歸屬。結(jié)果表明,除了5’n-1和3’n-1序列,其他一些微量雜質(zhì)(如5’(P=O)1)也能夠得到一定分離。
　　四、金剛乙胺修飾流感泰得化合物(Flutide-5'JG)的純化方法建立
　　Flutide-5'JG粗品中主要包括修飾失敗全長序列,縮短修飾序列,以及未修飾縮合不完全段片段及硫代

8、不完全產(chǎn)物。利用混合物的疏水性不同,采用反相色譜法純化Flutide-5'JG。由于離子對反相色譜法能同時(shí)分開n-1和(P=O)1雜質(zhì),故采用此方法對純化收集樣品進(jìn)行純度控制。純化收集樣品經(jīng)電噴霧質(zhì)譜進(jìn)行分子量鑒定與理論值相符,證明該方法可行。
　　本實(shí)驗(yàn)初步建立了Flutide-5'JG的純化工藝,純化規(guī)模達(dá)到了2.6克/批。優(yōu)化了其純化條件,確立了最佳的洗脫梯度。進(jìn)行了連續(xù)三批小試純化研究并檢測了產(chǎn)品純度。獲得的Flutide