病毒吸附對宿主細胞膜的影響及中藥的干預作用.pdf

1、病毒性疾病的危害已威脅到人類生存，在2006年3月由國際醫(yī)學科學院組織召開的第二屆全球大會上，500名專家指出：不斷變化的病毒使全球處于大流行的危險之中。WHO等單位聯(lián)合發(fā)布的《發(fā)展中國家疾病控制優(yōu)先項目》中指出：人類衛(wèi)生面臨的四大挑戰(zhàn)，其中第三項為新發(fā)病毒性疾病的大流行。 隨著分子生物學理論和技術在病毒學研究中的應用，盡管現(xiàn)代醫(yī)學對病毒感染機制的認識有了飛越性的發(fā)展，但控制手段始終沒有突破性進展，尋找有效的控制病毒性疾病的手段

2、已成為21世紀人類的重要事件。 中醫(yī)藥防治病毒性疾病有數(shù)千年的經(jīng)驗和完整的理論體系，是中醫(yī)藥治病的優(yōu)勢領域。以其療效確切、相對廣譜、低毒的特點已被世人所接受，醫(yī)學界期待從中醫(yī)藥中發(fā)現(xiàn)控制病毒性疾病的有效藥物。近20年來，雖然大量的試驗證實了中藥治療病毒性疾病的有效，尤其是SARS以后國內(nèi)外從中藥中尋找有效的抗病毒成分成為熱點，但直至目前抗病毒中藥的研制并沒有突破性進展。其原因①缺乏充分體現(xiàn)中醫(yī)藥治療病毒性疾病特點的研究思路；②缺

3、乏充分體現(xiàn)中醫(yī)藥治療病毒性疾病特點的研究手段。因此，在中醫(yī)藥治療病毒性疾病理論的指導下，應用現(xiàn)代生物學技術和手段研究中藥治療病毒性疾病的機理，對中藥走向世界具有重要的現(xiàn)實意義。 本研究在原有抗病毒藥效試驗和抗病毒作用機理研究的基礎上，從病毒吸附環(huán)節(jié)的一些非特異性病理生理環(huán)節(jié)入手，以2～3種病毒株為樣本，進一步探討病毒吸附細胞的生物學機制和中藥梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮對此環(huán)節(jié)的干預作用，為尋找中藥抗病毒作用的真正靶點奠定基礎。

4、本論文的研究內(nèi)容為國家自然科學基金面上項目資助課題的部分內(nèi)容。 一、梔子提取物ZG及半枝蓮總黃酮的體外抗病毒作用研究以Hep-2細胞株作為宿主細胞，以阿昔洛韋作為抗單純皰疹病毒1型的陽性對照藥，采用致細胞病變法(cytopathiceffectCPE)來觀察梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮對4種病毒致細胞病變作用的影響，并按Reed-Muench方法計算最大無毒濃度(TC0)，50﹪細胞毒性濃度(TC50)，50﹪抑制濃度(IC50

5、)和治療指數(shù)(TI)。結果顯示：梔子提取物ZG對Hep-2細胞的TC0和TC50分別為5mg·mL-1和12.74mg·mL-1；半枝蓮總黃酮對Hep-2細胞的TC0和TC50分別為3.13mg·mL-1和8.91mg·mL-1；阿昔洛韋的TC0和TC50分別為0.2mg·mL-1和1.14mg·mL-1。梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮均對單純皰疹病毒1型(HSV-1)和副流感病毒1型(PIV-1)所引起的細胞病變有明顯抑制作用，半枝蓮總

6、黃酮對呼吸道合胞病毒(RSV)有明顯的抑制作用；兩者對柯薩奇B族病毒4型(CoxB4)均無明顯抑制作用。其中，梔子提取物ZG對HSV-1的IC50為0.45mg·mL-1，TI為28.31；對PIV-1的IC50為1.00mg·mL-1，TI為12.68。半枝蓮總黃酮對HSV-1的IC50為1.28mg·mL-1，TI為6.96；對PIV-1的IC50為1.41mg·mL-1，TI為6.32；對RSV的IC50為0.68mg·mL-1，

7、TI為13.10。陽性對照藥阿昔洛韋對PIV-1的IC50和TI分別為0.05mg·mL-1和19.05。 二、病毒吸附對宿主細胞膜電位的變化及中藥的干預作用運用細胞膜電位特異性熒光探針DiBAC4(3)標記Hep-2細胞膜電位，以流式細胞儀為檢測手段，觀察3種不同病毒(HSV-1，PIV-1，Ad-3)吸附過程中宿主細胞膜電位的變化情況；并以氯化乙酰膽堿為陽性對照，探討中藥梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮對此過程的干預作用，為研究

8、病毒吸附宿主細胞的生物學機制及中藥對此環(huán)節(jié)的干預作用提供理論依據(jù)。結果顯示：正常Hep-2細胞膜電位熒光值在靜息狀態(tài)下基本穩(wěn)定在65-75范圍內(nèi)；2種中藥對正常細胞膜電位基本無影響；HSV-1和PIV-1病毒吸附30min內(nèi)，膜電位下降，處于超級化狀態(tài)；2種中藥均分別以3種加藥方式作用后，對HSV-1和PIV-1吸附過程中Hep-2細胞膜電位的超極化狀態(tài)均沒有明顯影響。結論：病毒吸附宿主細胞過程中使膜電位持續(xù)下降，處于超極化狀態(tài)，從而有

9、利于病毒的內(nèi)化，可能為病毒感染的生物學機制之一。乙酰膽堿對病毒吸附過程中膜電位的下降有明顯改善的作用，而梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮對此無明顯干預作用，說明中藥抗病毒機理可能與此環(huán)節(jié)無關。 三、病毒吸附對宿主細胞膜Na+-K+-ATP酶活性的影響及中藥的干預作用采用定磷法和分光光度計檢測HSV-1和PIV-1吸附后Hep-2細胞膜上Na+-K+-ATP酶活性的變化，以探討病毒吸附環(huán)節(jié)的生物學機制。同時設肝素鈉為陽性對照藥，觀察中

10、藥梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮在三種不同加藥方式作用后，對HSV-1和PIV-1吸附后Na+-K+-ATP酶活性變化的干預作用。結果顯示：HSV-1和PIV-1在吸附Hep-2細胞過程中，細胞膜Na+-K+-ATP酶活性均顯著增加，與正常細胞組比較有顯著性差異；梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮在3種加藥方式作用下，對HSV-1和PIV-1吸附后Na+-K+-ATP酶活性均有顯著的升高趨勢，但與病毒對照組比較均無顯著性差異；肝素鈉在3種加藥方

11、式作用下，對HSV-1吸附后Na+-K+-ATP酶活性均有降低的趨勢，其中以先加藥后病毒吸附組最為顯著，但與病毒對照組比較均無顯著性差異。結論：在HSV-1和PIV-1內(nèi)化過程中，膜Na+-K+-ATP酶活性升高，說明在HSV-1和PIV-1感染細胞的過程中確實有能量的參與，病毒借助ATP水解產(chǎn)生的能量感染宿主細胞，但其具體的生物學機制有待進一步研究。中藥梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮在其有效劑量內(nèi)，3種加藥方式下，均有升高病毒吸附后宿主

12、細胞膜Na+-K+-ATP酶活性的趨勢，由于國內(nèi)外目前未見該方面的研究和報道，中藥對此環(huán)節(jié)可能的作用機制需要進一步研究。肝素鈉具有封閉HSV-1配體的作用，可通過阻斷HSV-1吸附來間接干預Na+-K+-ATP酶活性的升高；但與HSV-1對照組比較沒有顯著性差異提示與病毒量比較肝素鈉用量可能相對不足。 四、病毒吸附對宿主細胞膜流動性的影響及中藥的干預作用以往研究發(fā)現(xiàn)正常細胞膜具有良好的流動性，漂白后熒光恢復率為73.89﹪；HS

13、V-1感染后Hep-2細胞膜流動性顯著降低，熒光恢復率為18.54﹪；梔子提取物ZG3種用藥方式作用下，均可明顯改善HSV-1感染細胞膜的流動性。本研究中除進一步驗證梔子提取物ZG對HSV-1吸附后Hep-2細胞膜流動性的影響外，同時又觀察PIV-1吸附后細胞膜流動性的變化及半枝蓮總黃酮對細胞膜流動性的影響。結果顯示：正常細胞膜具有良好的流動性，熒光恢復率為72.66﹪；HSV-1和PIV-1吸附后Hep-2細胞膜流動性均顯著降低，熒光

14、恢復率分別為為26.73﹪和19.85﹪；梔子提取物ZG在3種不同用藥方式作用下，均可明顯改善HSV-1和PIV-1吸附后細胞膜的流動性，與病毒感染對照組比較均有顯著性差別；在半枝蓮總黃酮3種用藥方式中，對HSV-1感染的影響，其中先用藥處理后病毒吸附組和藥物處理同時病毒吸附兩組可明顯改善細胞膜流動性，擴散系數(shù)和熒光恢復率均顯著升高，并與病毒對照組比較有顯著性差異；而先病毒吸附后藥物作用組以及對PIV-1的3個不同用藥組對細胞膜流動性均