以DNA和蛋白質(zhì)為探針的固液界面單分子熒光成像研究.pdf

1、生命科學(xué)本質(zhì)的逐步探索和科學(xué)研究對傳統(tǒng)分析提出了新的要求。以往常規(guī)的分析和檢測方法得到的測量結(jié)果只是分子群體的平均值，而生命的基本過程取決于細(xì)胞內(nèi)不同分子與同類分子之間的協(xié)調(diào)作用，因此，欲了解生物過程的化學(xué)性質(zhì)及其運(yùn)作機(jī)制，人們必須在單分子水平對生物分子的化學(xué)和物理性質(zhì)進(jìn)行深入探索。 單分子檢測( Single Molecule Detection，SMD)是一種超靈敏的檢測技術(shù)，經(jīng)過二十多年的發(fā)展，單分子單細(xì)胞檢測為揭示物理學(xué)

2、、化學(xué)，特別是生命運(yùn)動的規(guī)律提供了重要的手段。單分子熒光成像技術(shù)是SMD技術(shù)中應(yīng)用最廣、獲得信息最多的方法之一。 在過去的十幾年來，單分子熒光成像技術(shù)已經(jīng)能夠成功探測和實(shí)時追蹤到固。液界面、液-液界面和活細(xì)胞內(nèi)等不同微環(huán)境下單個分子的生理特性。固-液界面是DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子在體外研究和應(yīng)用的最重要的界面之一。通過單分子熒光成像實(shí)驗(yàn)可以記錄以前未曾實(shí)時看到的單個分子的定位、運(yùn)動軌跡、多聚體形成、動態(tài)變化及動力學(xué)過程等。這對

3、于探索細(xì)胞的活動、闡明生物分子在細(xì)胞表面的生物過程、設(shè)計新的生物材料、尋找傳感器中最佳的基底材料、理解色譜和毛細(xì)管電泳的分離機(jī)制是很關(guān)鍵的。 基于上述原因，本論文開展了以下三個方面的工作： (1)單分子熒光成像中的圖像處理優(yōu)化研究 圖像處理與分析是單分子熒光成像研究的關(guān)鍵性內(nèi)容。單分子熒光成像的圖像處理與圖像分析貫穿整個實(shí)驗(yàn)過程，但又是一項繁瑣而艱巨的任務(wù)。免費(fèi)開源軟件Image J軟件使用起來方便、快捷，在提高

4、圖像分析可靠性的同時，大大節(jié)約了數(shù)據(jù)分析的時間，為單分子熒光成像分析提供了重要的工具。基于此，本章主要研究了Image J軟件在識別單個生物大分子的吸附/解吸附事件、計算單分子的吸附個數(shù)、測定單個分子的熒光強(qiáng)度和單個分子的漂白步驟(漂白曲線)等方面的應(yīng)用，重點(diǎn)討論了單分子熒光成像分析中圖像疊加的幀數(shù)、二維旋轉(zhuǎn)球法扣除背景中小球半徑、粒子計數(shù)分析中閾值和單個光斑像素大小的正確選取對單分子吸附個數(shù)計算結(jié)果可靠性的影響。以單個藻紅蛋白分子在界

5、面吸附成像為例，證明了這些參數(shù)的選取和優(yōu)化對單分子熒光成像分析結(jié)果可靠性有很大的影響。 (2) DNA在瓊脂糖修飾的玻璃表面行為的單分子熒光成像研究 瓊脂糖凝膠常用于凝膠電泳中分離和純化核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。分離過程中固定相和單個生物分子之間的動態(tài)相互作用正是色譜和電泳等生物分離方法最優(yōu)化的基礎(chǔ)。本論文應(yīng)用物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡，以YOYO-1為探針研究了瓊脂糖的表面性質(zhì)，主要考察了不同的pH值、離子強(qiáng)度和瓊脂糖濃

6、度對DNA吸附動力學(xué)行為的影響。得出的結(jié)論為：DNA分子在瓊脂糖表面的吸附量和吸附形式隨pH值和離子強(qiáng)度的變化是不同的；DNA在不同濃度瓊脂糖表面的吸附行為可歸結(jié)為靜電作用、疏水作用和瓊脂糖表面粗糙度三重作用的影響，主導(dǎo)作用是靜電作用、疏水作用，瓊脂糖表面的構(gòu)形在某種程度上也影響著DNA的吸附。 (3)巰基乙醇對藻紅蛋白單分子行為影響的熒光成像研究 熒光團(tuán)的光致漂白和閃爍現(xiàn)象嚴(yán)重影響單分子熒光成像研究。在單分子熒光研究中

7、，加入巰基乙醇(2-Mercaptoethanol，BME)可以降低熒光團(tuán)的漂白速率、減弱閃爍現(xiàn)象，從而提高單分子熒光檢測的分辨率和靈敏度。然而，BME對單分子其它行為如吸附和熒光強(qiáng)度的影響并未得到充分研究。本論文應(yīng)用寬場熒光成像技術(shù)，以藻紅蛋白( B-phycoerythrin，B-PE)為模型蛋白，從單分子角度系統(tǒng)地研究了BME對蛋白在固-液界面吸附的影響，并對其機(jī)理進(jìn)行了探討。結(jié)果表明：BME濃度的增加可增強(qiáng)B-PE在蓋玻片表面的

8、吸附，吸附個數(shù)大約可增加到最初的16.0倍，同時也可使其熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，但是更高濃度(5.00 mmol/L)的BME可使蛋白部分變性使其吸附個數(shù)降低，光斑的平均熒光強(qiáng)度降低；這些結(jié)果與熒光光譜的結(jié)果相一致。 通過以上研究實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確、快速的單分子熒光成像分析，并通過實(shí)時觀測固-液界面分子的動力學(xué)過程，成功研究了影響生物大分子表面吸附機(jī)理的基本相互作用，為探測色譜和電泳的分離機(jī)制，DNA芯片和生物芯片的制作提供了更加詳細(xì)的基礎(chǔ)理論依