微包埋培養(yǎng)技術(shù)的建立及其在粘細(xì)菌分離純化中的應(yīng)用.pdf

1、社會(huì)性的粘細(xì)菌在生長過程中呈現(xiàn)出聚團(tuán)生長和細(xì)胞密度依賴性等社會(huì)性行為。具體表現(xiàn)為，當(dāng)細(xì)胞的接種密度低于105cells/ml時(shí)，細(xì)胞不能在新的環(huán)境中生長起來，而細(xì)胞一旦生長起來，大量的細(xì)胞聚集在一起形成一個(gè)個(gè)緊密的菌團(tuán)。粘細(xì)菌這種協(xié)同成長的特性嚴(yán)重限制了粘細(xì)菌的分離純化工作，如纖維堆囊菌埃博霉素生物合成改造后期突變株的分離純化。
　　 在本文的工作中，我們以SA-CaC12體系為基礎(chǔ)進(jìn)行包埋條件的優(yōu)化，建立了以1.2％SA為凝膠

2、介質(zhì)，2％ SrCl2為交聯(lián)劑的包埋體系。通過此體系，我們制備得到了為直徑為1.2士0.5 mm的凝膠球粒，其中約80％的凝膠球粒直徑為lmm以內(nèi)；每毫升SA凝膠可制備1500-2500個(gè)球粒。將分散至單細(xì)胞狀態(tài)的纖維堆囊菌細(xì)胞包埋在海藻酸鍶凝膠球粒中。通過控制單細(xì)胞懸液的濃度及凝膠球粒的直徑及數(shù)目，實(shí)現(xiàn)了對單個(gè)纖維堆囊菌細(xì)胞的包埋。通過與高濃度、未包埋的纖維堆囊菌細(xì)胞共同培養(yǎng)，最終實(shí)現(xiàn)了凝膠球粒內(nèi)單個(gè)細(xì)胞的生長。含有細(xì)胞的凝膠球粒在高

3、濃度磷酸鹽的平板上溶脹后，通過將其轉(zhuǎn)接到正常的培養(yǎng)基上，實(shí)現(xiàn)了對內(nèi)部細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)，從而獲得了純化的單克隆。應(yīng)用此方法，我們將預(yù)先混合的、同源性為99％的兩株纖維堆囊菌進(jìn)行分離。隨機(jī)挑選的18個(gè)凝膠球粒內(nèi)的細(xì)胞經(jīng)16S rRNA測序證實(shí)，球粒內(nèi)部生長起來的細(xì)胞為同種細(xì)胞。由此，我們實(shí)現(xiàn)了對纖維堆囊菌混合培養(yǎng)物的分離純化。此技術(shù)一方面利用海藻酸鹽凝膠介質(zhì)的交聯(lián)結(jié)構(gòu)將細(xì)胞限定在一定的空間內(nèi)，阻斷了纖維堆囊菌細(xì)胞生長過程中的粘連聚集；另一方面

4、，通過將包埋有單細(xì)胞的凝膠球粒與未包埋的高濃度細(xì)胞共同培養(yǎng)，利用凝膠介質(zhì)形成的交聯(lián)網(wǎng)孔允許細(xì)胞生長所需要的生長起始因子自由通過的能力，幫助凝膠球粒內(nèi)極低密度的細(xì)胞克服細(xì)胞密度依賴性而順利生長增殖。
　　 在建立的微包埋培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，我們以纖維堆囊菌野生菌株作為助長菌株，對實(shí)驗(yàn)室前期得到的埃博霉素生物合成改造突變株進(jìn)行包埋純化。隨機(jī)挑選4株經(jīng)包埋培養(yǎng)得到的突變株進(jìn)行epothilone產(chǎn)量檢測，得到了具備突變株遺傳特性的、埃博

5、霉素產(chǎn)量存在顯著差異的單克隆。該技術(shù)克服了纖維堆囊菌突變株傳統(tǒng)分離純化過程中純化效率低下且耗時(shí)較長的弊端，將大大加快纖維堆囊菌次級代謝途徑改造的工作進(jìn)程，提高工作效率。
　　 粘細(xì)菌的分離純化通常是利用粘細(xì)菌能夠形成子實(shí)體的能力進(jìn)行的。該方法有許多的局限性，例如，單個(gè)粘細(xì)菌細(xì)胞不容易形成菌落；子實(shí)體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在許多情況下，子實(shí)體會(huì)退化甚至是丟失；粘細(xì)菌的低生長率使得粘細(xì)菌很容易受到其它快速生長的細(xì)菌和真菌的污染?？紤]到這些局限

6、性，我們將建立的微包埋培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于開發(fā)土壤中溶細(xì)菌型粘細(xì)菌資源。通過采用不同的粘細(xì)菌種屬作為助長菌株，我們對同一土樣進(jìn)行了四批包埋培養(yǎng)。我們以粘細(xì)菌孢囊桿菌亞目特異性探針為篩選手段，以凝膠球粒內(nèi)生長的粘細(xì)菌的16S rRNA基因部分序列(448bp)為基礎(chǔ)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。通過進(jìn)化樹分析，我們從土壤中分離得到了大量溶細(xì)菌型粘細(xì)菌，這部分粘細(xì)菌獨(dú)立于課題組之前從該土樣中分離得到的粘細(xì)菌。對這部分粘細(xì)菌進(jìn)行人工后續(xù)培養(yǎng)得到了15株粘細(xì)菌，對