環(huán)糊精置換色譜及其在抗體分離純化中的應(yīng)用.pdf

1、單克隆抗體藥物已經(jīng)成為目前最具產(chǎn)業(yè)價值的生物功能分子，其種類和銷售額正逐年增高。隨著市場需求和生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴大，如何通過改進現(xiàn)有的色譜技術(shù)方法，提高抗體產(chǎn)品的分離效率是目前生物工程領(lǐng)域迫切需要解決的問題。本論文針對常規(guī)疏水色譜和疏水電荷誘導(dǎo)色譜在使用過程中存在苛性條件，導(dǎo)致分離能力和經(jīng)濟性偏低，不利于規(guī)?；褂玫膯栴}，提出了一種基于超分子置換洗脫模式的疏水色譜方法。該技術(shù)原理借助環(huán)糊精與疏水配基的包結(jié)作用置換洗脫疏水結(jié)合蛋白，從而能夠

2、保證整個色譜過程在生理條件下進行。本論文的研究內(nèi)容包括以下幾個方面:
　　(1)針對混合模式層析(MEP-HCIC)的置換洗脫方法:通過分子對接方法評估了不同類型環(huán)糊精（α-，β-，γ-，及羥丙基-β-環(huán)糊精）與4-巰基乙基吡啶（MEP色譜配基）之間的主客體相互作用，結(jié)合實際實驗驗證發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精對MEP結(jié)合的人免疫球蛋白G(IgG)具有最理想的置換洗脫效果。生理溶液條件下，15mMβ-環(huán)糊精可有效洗脫目的蛋白，回收率達到87％，

3、洗脫效果受溶液pH值和鹽濃度影響不顯著。該方法從血清中分離IgG與酸洗脫純度相當(dāng)，首次實現(xiàn)了中性條件下抗體產(chǎn)品的有效洗脫。
　　(2)基于環(huán)糊精置換洗脫的非鹽依賴型疏水色譜方法:通過等溫滴定量熱法測定出β-環(huán)糊精與苯甲酸之間的結(jié)合常數(shù)為4.1×103M-1，論證了其從苯基疏水介質(zhì)上置換洗脫的可行性。制備了不同配基密度的苯基疏水介質(zhì)，并測定其對人IgG的動態(tài)吸附量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)特殊密度優(yōu)化，可實現(xiàn)生理溶液條件下疏水介質(zhì)對人IgG的非鹽依賴

4、型吸附，同時，β-環(huán)糊精置換洗脫效率也與配基密度相關(guān)。綜合以上因素，確定62μmol/mL為最適配基密度。最終，采用β-環(huán)糊精洗脫液能夠從復(fù)雜體系（人血清）中有效分離人IgG，且該疏水分離體系可實現(xiàn)從上樣到洗脫都在生理溶液條件下完成。
　　(3)環(huán)糊精置換色譜方法的拓展應(yīng)用:在傳統(tǒng)混合模式配基和苯基疏水配基的基礎(chǔ)上，本研究在更大范圍評估了環(huán)糊精-疏水分子的相互作用及色譜效果，以期篩選新配基，拓展超分子置換色譜方法的應(yīng)用。通過等溫滴

5、定量熱法，分析了β-環(huán)糊精與一系列疏水性藥物分子之間的相互作用，并制備疏水介質(zhì)，以IgG為模式蛋白，對其進行動力學(xué)與熱力學(xué)評價。結(jié)果表明在生理條件下，以布洛芬為功能基的疏水介質(zhì)對IgG有很高的吸附載量，通過環(huán)糊精洗脫能夠?qū)崿F(xiàn)90％的蛋白回收，具有應(yīng)用于抗體分離的潛力。
　　本論文的研究結(jié)果擴展了疏水電荷誘導(dǎo)色譜和疏水色譜作為經(jīng)濟型色譜在抗體分離領(lǐng)域的應(yīng)用。首次實現(xiàn)非鹽依賴的疏水色譜方法，提出并建立了超分子置換色譜的技術(shù)方法，并初步