呼吸道合胞病毒復制相關宿主因子的高通量篩選及血小板因子4抗病毒機制研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是感染人類的重要呼吸道病毒，主要感染兒童、老人及免疫力低下人群，可導致包括肺炎和支氣管炎在內(nèi)的嚴重呼吸道疾病，每年在全球造成3380萬感染病例和6.6～25.4萬死亡病例，是世界范圍內(nèi)導致兒童死亡的主要原因之一。雖然針對RSV的疫苗和治療性抗體研究取得了一定進展，但目前尚無商品化的疫苗和高效的抗病毒干預手段。研究病毒宿主因子有助于發(fā)現(xiàn)新的抗病毒靶點，是當前領

2、域內(nèi)研究熱點和重點。目前對RSV在感染過程中如何影響宿主免疫防御已有一定了解，但對宿主因子在RSV感染中的作用研究較少，尤其缺乏在基因組水平上對RSV復制相關宿主因子的全面認識。為了更全面闡釋RSV復制相關宿主因子及其功能，本研究基于含有10001個人類基因cDNA表達文庫的高通量篩選，分析影響RSV復制的宿主因子，發(fā)現(xiàn)59個宿主因子與RSV的復制相關，通過功能驗證，對其中抑制病毒復制功能最強的血小板因子4(Platelet facto

3、r4，PF4)開展了深入的抗病毒功能與機制研究。
　　在RSV宿主限制因子篩選中，本研究將人eDNA表達文庫與高通量細胞轉染技術相結合，用液體工作站和高內(nèi)涵顯微成像設備，通過免疫熒光分析病毒蛋白表達水平，在RSV感染細胞模型中實現(xiàn)外源基因的過表達和高通量篩選，分析與RSV復制相關的宿主因子。通過實驗條件篩選，獲得了自動化、高通量和信噪比良好（6.7±0.3）的優(yōu)化研究體系，完成10001個人類基因cDNA的篩選。以RSVN蛋白熒光

4、信號強度為指標，計算感染率并轉換為z score，z score的絕對值反映樣本的變異程度，其數(shù)值的正負反映變異的方向性。細胞數(shù)量z score≥-3的樣本為有效數(shù)據(jù)。以感染率z score=±2作為閾值，z score＞2的基因為對RSV復制有促進作用，z score＜-2的為有抑制作用。篩選共獲得355個與RSV病毒復制相關的目標基因，其中122個有正調(diào)控作用，233個有負調(diào)控作用。上述基因經(jīng)二次驗證篩選，確定了細胞色素C氧化酶組裝

5、因子1同系物(COA1)、泛素樣修飾物激活酶1(UBA1)等10個基因具有正向調(diào)控病毒復制的作用，γ-干擾素(IFNG)、血小板因子4(PF4)等49個基因具有負調(diào)控作用。利用Western blot和RT-PCR方法對上述篩選后的基因進行功能驗證，確定其對RSV N基因的表達具有相應的上調(diào)或下調(diào)作用。
　　在篩選發(fā)現(xiàn)的RSV限制性宿主因子中，PF4具有較高的病毒感染抑制率。PF4是一種分泌型表達的細胞因子，具有調(diào)節(jié)造血功能、促進

6、凝血與創(chuàng)傷愈合、免疫調(diào)節(jié)、抗血管新生等多種生理功能，在腫瘤、移植排斥反應和放化療導致的造血功能障礙治療中，PF4在動物模型中獲得了較好的效果。目前僅有兩個研究團隊報道了PF4可抑制流感病毒和HIV復制，對其抗病毒功能的了解還十分有限。為了闡釋PF4抑制RSV病毒復制的功能機制，首先分析了臨床RSV感染嬰幼兒外周血PF4濃度，發(fā)現(xiàn)與無呼吸道感染人群對照比較，其血漿PF4濃度顯著增高(p＜0.001)。進一步在細胞和動物水平對其分析對RSV

7、復制的作用機制。首先，通過在Hela細胞中轉染表達PF4蛋白，發(fā)現(xiàn)RSV N蛋白隨著PF4表達增加而降低，兩者存在劑量反應關系，而信號肽缺失的非分泌型PF4突變體對RSV復制無影響;進一步在HEp-2細胞的培養(yǎng)基中加入重組人PF4蛋白后再感染RSV，發(fā)現(xiàn)病毒復制受到抑制，且抑制率與PF4濃度呈正相關。上述結果表明分泌型PF4蛋白具有抑制RSV復制的作用。為確定分泌型PF4對病毒復制的抑制作用針對于吸附還是穿入階段，在病毒吸附前、進入階段

8、和進入結束后分別給予PF4處理，發(fā)現(xiàn)只有在吸附前和進入階段加入PF4蛋白才能下調(diào)細胞內(nèi)RSVN基因表達水平，在病毒吸附前加入PF4的病毒復制抑制作用能夠更強，提示PF4主要在RSV吸附階段發(fā)揮作用。PF4可高親和力結合多種糖胺聚糖，其中包括重要的RSV受體硫酸乙酰肝素（Heparan sμlphate，HS）。因此，推測PF4可能通過競爭性結合細胞表面HS而阻斷RSV對宿主細胞的吸附。通過將PF4蛋白與不同濃度的肝素混合后孵育HEp-2

9、細胞，棄去混合物后再用RSV感染細胞，發(fā)現(xiàn)RSV感染率隨肝素濃度上升而增加，表明PF4對RSV感染的阻斷依賴于肝素與HS結合能力;免疫熒光共聚焦技術發(fā)現(xiàn)HS與PF4和RSV在細胞膜表面分別存在共定位，但PF4與RSV未見共定位，提示PF4結合HS后阻斷了RSV對HS的吸附，限制了病毒的進入。用腸道病毒71(HS為其受體之一)和非HS受體依賴的流感病毒W(wǎng)SN為模型的研究，發(fā)現(xiàn)PF4對EV71的復制也具有抑制作用。以上結果表明PF4可通過結

10、合細胞表面受體HS，阻斷病毒吸附過程，發(fā)揮非特異性的抗病毒作用。在RSV小鼠感染模型中對PF4的抗病毒功能進行驗證，發(fā)現(xiàn)感染RSV小鼠肺部和血漿PF4水平顯著升高(p=0.005);經(jīng)鼻給予PF4能顯著降低小鼠肺部RSV載量，減輕肺部病理損傷，下調(diào)氣道IL-6炎性因子的水平，表明PF4能通過抑制宿主體內(nèi)病毒復制減輕RSV的病理損傷。上述結果表明內(nèi)源性PF4在宿主抗RSV感染中可能具有重要作用。
　　本文通過功能獲得性高通量篩選技術