羅非魚促攝食因子的畢赤酵母重組表達及其產(chǎn)物功能的初步研究.pdf

1、羅非魚(Tilapia)，俗稱非洲鯽魚，隸屬于鱸形目、鱸形亞目、麗魚科(Cichlidae)、羅非魚屬。印度Modadugu Vijay Gupta博士因發(fā)展推廣羅非魚清水廉價養(yǎng)殖技術，而獲得了2005年世界糧食獎。目前羅非魚已成為世界性的主要養(yǎng)殖魚類，且價格低廉，被譽為21世紀窮人的蛋白質(zhì)，也是中國主要出口經(jīng)濟魚類之一。本實驗研究從促攝食角度出發(fā)，以開發(fā)羅非魚新型環(huán)保飼料添加劑為目的，研究了在畢赤酵母中表達魚類促攝食因子神經(jīng)肽Y和gh

2、relin以及表達產(chǎn)物的生理活性功能。
　　 NPY是一種36氨基酸殘基的神經(jīng)活性多肽，屬具有YY肽和胰多肽結(jié)構(gòu)的多肽家族，80年代首先從豬腦分離，也是目前發(fā)現(xiàn)的分布最廣泛，含量最豐富的神經(jīng)肽之一。NPY是目前發(fā)現(xiàn)的最強勁的促攝食因子，在哺乳類及魚類中都發(fā)現(xiàn)NPY能強烈促進動物攝食。本實驗中我們首先從吉富羅非魚下丘腦中克隆了神經(jīng)肽Y的mRNA序列，并根據(jù)此序列構(gòu)建了兩種畢赤酵母分泌型表達載體pPICZaA-TiNPY1和pPIC

3、ZaA-TiNPY2。這兩種載體經(jīng)線性化后分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33，經(jīng)篩選鑒定構(gòu)建了能高效表達重組羅非魚神經(jīng)肽Y的重組畢赤酵母菌株pPICZaA-TiNPY1-X-33和pPICZaA-TiNPY2-X-33。這兩種重組菌株經(jīng)甲醇誘導分別分泌表達了兩種NPY重組蛋白TiNPY1和TiNPY2，通過蛋白質(zhì)N-末端氨基酸序列測定，本研究發(fā)現(xiàn)可能是由于受NPY蛋白N-端序列的影響，重組蛋白TiNPY1、TiNPY2 N-信號肽剪切不完全或剪切

4、過度，使每種重組蛋白都出現(xiàn)不止一種大小的目的蛋白。
　　 本實驗通過在體投喂實驗初步檢測了重組蛋白TiNPY1、TiNPY2的生理功能。把酵母表達培養(yǎng)上清直接噴灑于普通商業(yè)膨化飼料表面，制成了5種飼料分別為：重組蛋白TiNPY1含量為0.15、0.3、0.6μg TiNPY1/g feed的飼料、重組蛋白TiNPY2含量為0.3μg TiNPY2/g feed的飼料、噴灑陰性對照酵母表達上清的飼料。我們把180尾體重為60-80

5、g、體長為12.0-14.0cm的羅非魚隨機分到15個玻璃缸中，這15個缸隨機分為5組，每三缸作為同一組投喂上述其中一種飼料，投喂50天。結(jié)果表明TiNPY1、TiNPY2均能明顯促進羅非魚攝食、生長，降低飼料系數(shù)(FCR)。其中重組蛋白TiNPY2的作用更為明顯：投喂0.3μg TiNPY2/gfeed的實驗組比對照組平均個體末體重提高了22.45％(P＜0.001)；飼料攝取量提高了30.22％(P＜0.001)；平均體長也明顯高于

6、對照組(P＜0.001)而飼料系數(shù)FCR明顯降低(P＜0.01)；并且能明顯提高垂體GH的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P＜0.05)，而下丘腦NPY與Orexin的mRNA轉(zhuǎn)錄受到抑制(P＜0.01)。
　　 Ghrelin也是一種在哺乳動物及魚類中發(fā)現(xiàn)的重要的促攝食因子和GH釋放因子，也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的第三位Ser辛?；揎椀鞍?。這種特殊的?；瘜τ谄浯貵H釋放及攝食功能尤為重要。本實驗利用畢赤酵母表達系統(tǒng)按照表達NPY的類似方法表達