補腎法、疏肝法對體外培養(yǎng)小鼠卵泡發(fā)育過程中卵母細胞GDF-9及其Smads信號通路影響的研究.pdf

1、目的:針對體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)中妊娠率低、流產(chǎn)率高等問題，在前期研究證實補腎法、疏肝法具有提高臨床妊娠率、改善妊娠結(jié)局、提高卵母細胞質(zhì)量作用的基礎(chǔ)上，研究補腎法、疏肝法在小鼠體外卵泡發(fā)育過程中對卵母細胞GDF-9及其信號通路的調(diào)控作用，以探討兩法改善卵母細胞質(zhì)量的作用機制，比較兩法作用機制及作用環(huán)節(jié)之異同。
　　方法:含藥血清制備:取28只

2、6周齡健康雌性SD大鼠按體重隨機分為7組:疏肝低劑量組、疏肝中劑量組、疏肝高劑量組、補腎低劑量組、補腎中劑量組、補腎高劑量組、空白組。實驗用逍遙丸為河南宛西制藥股份有限公司生產(chǎn)，將48粒逍遙丸溶于100ml蒸餾水中制成混懸液，混懸液含生藥0.18g/ml。補腎調(diào)經(jīng)方所需藥材一次性購自石家莊市樂仁堂藥店，并由本校中藥系制成口服液，口服藥含生藥1.62g/ml?？瞻讓φ战M每日灌服生理鹽水2ml/100g體重;補腎調(diào)經(jīng)方組高、中、低劑量組和疏

3、肝高、中、低劑量組每日灌服補腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸3ml/100g體重、2ml/100g體重、1ml/100g體重（分別相當于成人劑量的18倍、12倍、6倍，每日分兩次給藥，連續(xù)4天。于末次給藥后1h大鼠股動脈采血。室溫靜置2h離心(3000rpm，10min)，取上清，56℃水浴30min滅活補體，0.22μm無菌濾器過濾除菌，得補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸低、中、高劑量大鼠含藥血清和正常大鼠血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　選用出生D12昆明乳鼠

4、432只，分3批進行實驗，每批144只，隨機分為8組:補腎低劑量組、補腎中劑量組、補腎高劑量組，疏肝低劑量組、疏肝中劑量組、疏肝高劑量組、正常組、空白組，每組18只（3批每組共54只）。
　　分離竇前卵泡:采用機械法分離。將昆明乳鼠頸椎脫臼處死，取出雙側(cè)卵巢，用含青、鏈霉素各200IU/mL的α-MEM培養(yǎng)液清洗1-2次，在帶有目鏡標尺的體視顯微鏡下用針頭對卵巢進行分離，選擇直徑在80-120μm之間的竇前卵泡。
　　竇前卵

5、泡培養(yǎng):35mm培養(yǎng)皿中置2ml培養(yǎng)液，37℃、5％CO2(V/V)、100％濕度培養(yǎng)，24h后卵泡貼壁。分別加入補腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸大鼠含藥血清，分為補腎組和疏肝組，補腎含藥血清組與疏肝含藥血清組分別設(shè)置低、中、高三個劑量組，正常大鼠血清為正常組，不加血清為空白組。培養(yǎng)6d，隔天換液1/2;0.25％膠原酶消化竇前卵泡，分離得卵母細胞，第一批置于液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆?用于實時熒光定量PCR)。第二批迅速放入2％多聚甲醛中固定（用于

6、免疫組化）。第三批迅速放入2％多聚甲醛固定（用于免疫熒光）。
　　通過倒置顯微鏡觀察卵泡形態(tài)及成活數(shù);采用實時熒光定量PCR檢測GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表達;采用免疫組化法、免疫熒光法檢測卵母細胞中上述指標蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1卵泡生長過程中形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化
　　體外培養(yǎng)第2天，竇前卵泡貼壁，固定于培養(yǎng)皿底，不能移動;第4天卵泡顆粒細胞數(shù)目明顯增多，

7、培養(yǎng)皿底平鋪一層細胞;第6天顆粒細胞層數(shù)增多，顆粒細胞越過卵泡基底膜生長，卵泡逐漸失去球形的三維結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)變成為煎蛋樣外觀。消化卵泡膜細胞及顆粒細胞后，可見卵母細胞。
　　2空白組、正常組、疏肝及補腎各劑量組竇前卵泡成活數(shù)的比較
　　在卵泡的體外培養(yǎng)過程中，D2各組卵泡成活數(shù)比較，疏肝高劑量組及補腎高劑量組較其它各組成活數(shù)均有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;D4各組卵泡成活數(shù)比較，疏肝高劑量組、補腎中劑量組及補腎

8、高劑量組較其它各組均有增高趨勢，其中補腎高劑量組卵泡成活數(shù)較其它各劑量組均增高且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在體外培養(yǎng)D6，與空白對照組比較，正常組卵泡成活數(shù)有增多趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05);與空白對照組比較，疏肝低、中、高劑量組和補腎低、中、高劑量組的卵泡成活數(shù)增高，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）;與正常組比較，補腎各劑量組和疏肝各劑量組的卵泡成活數(shù)均升高，其中補腎高劑量組卵泡成活數(shù)最高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.0

9、5)，其余依次為疏肝中劑量組、疏肝高劑量組、補腎中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;疏肝低劑量組及補腎低劑量組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　3各組體外培養(yǎng)小鼠卵母細胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表達
　　3.1體外培養(yǎng)不同時間點各劑量組間GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表達
　　空白組及正常組:與D2

10、比較，D4、D6 GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達均降低(均P＜0.05)，且D6較D4表達更低（P＜0.05）。疏肝各劑量組:與D2比較，D4、D6 GDF-9 mRNA表達均降低(均P＜0.05)，且D6較D4表達更低(P＜0.05);BMPRⅡ、ALK5mRNA表達均降低(均P＜0.05)，且D6較D4表達更低（P＜0.05）;與D2比較，D4、D6 Smad2、Smad3、Sma

11、d4 mRNA表達有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。補腎各劑量組:與D2比較，D4、D6 GDF-9mRNA表達均降低(均P＜0.05)，且D6較D4表達更低(P＜0.05); BMPRⅡ、ALK5 mRNA表達均降低（P＜0.05），且D6較D4表達更低（P＜0.05）;D2、D4、D6 Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。
　　3.2各組之間小鼠卵母細胞中GDF-9、B

12、MPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表達
　　在體外培養(yǎng)的D2、D4、D6:
　　正常組較空白組卵母細胞中GDF9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、 Smad3、Smad4 mRNA表達均有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）;
　　與空白組、正常組比較，疏肝低、中、高劑量組卵母細胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達均升高（均P

13、＜0.05）;且疏肝中劑量組GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達高于疏肝高劑量組及疏肝低劑量組（均P＜0.05）;疏肝高劑量組表達高于疏肝低劑量組(P＜0.05)。與正常組、空白組比較，補腎低、中、高劑量組的卵母細胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表達升高（均P＜0.05）;且補腎高劑量組GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、

14、Smad4 mRNA表達較補腎中、低劑量組均升高(均P＜0.05)，呈劑量依賴性。
　　疏肝低、中、高劑量組與補腎低、中、高劑量組之間比較，補腎高劑量組卵母細胞中GDF-9、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表達高于疏肝中劑量組，其次各組表達由高至低依次為補腎中劑量組、疏肝高劑量組、補腎低劑量組、疏肝低劑量組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各治療組之間ALK5 mRNA表達比較，補腎高劑量組表達最強，差異有統(tǒng)計學

15、意義（P＜0.05），其次依次是疏肝中劑量組、補腎中劑量組、補腎低劑量、疏肝高劑量組、疏肝低劑量組。各治療組之間BMPRⅡmRNA表達比較，疏肝中劑量組表達最高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余依次是疏肝高劑量組、補腎高劑量組、補腎中劑量組、疏肝低劑量組和補腎低劑量組。
　　4各組體外培養(yǎng)小鼠卵母細胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表達
　　4.1體外培養(yǎng)不同時間點各組小鼠卵

16、母細胞GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表達
　　空白組及正常組:與D2比較， D4、D6 GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達均降低(均P＜0.05)，且D6較D4表達更低（P＜0.05）。疏肝各劑量組:與D2比較， D4、D6 GDF-9蛋白表達均降低(均P＜0.05)，且D6較D4表達更低(P＜0.05); BMPRⅡ、ALK5、Smad4蛋白表

17、達均降低(均P＜0.05)，且D6較D4表達更低（P＜0.05）;與D2比較，D4、D6 Smad2、Smad3蛋白表達有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　補腎低、中、高劑量組:與D2比較，D4、D6 GDF-9蛋白表達均降低（均P＜0.05），且D6較D4表達更低(P＜0.05)。BMPRⅡ、ALK5蛋白表達均降低(均（P＜0.05)，且D6較D4表達更低（P＜0.05）。D2、D4、D6Smad2、Smad3

18、、Smad4蛋白表達有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義。
　　4.2各組之間小鼠卵母細胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表達
　　在體外培養(yǎng)的D2、D4、D6:
　　正常組比空白組卵母細胞中GDF9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達均升高(均P＜0.05)。
　　與空白組、正常組比較，疏肝低、中、高劑量組卵母細胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5

19、、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達升高（均P＜0.05）;且疏肝高劑量組蛋白表達最高，其次為疏肝中、低劑量組，呈劑量依賴性。與正常組、空白組比較，補腎低、中、高劑量組的卵母細胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達升高（均P＜0.05）;且補腎高劑量組蛋白表達最高，其次為補腎中劑量組和補腎低劑量組，呈劑量依賴性。
　　疏肝低、中、高劑量組與補腎低、中、高劑量組之間比較，補腎高劑量組

20、卵母細胞中GDF-9、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表達高于疏肝高劑量組，其次分別為補腎中劑量組、疏肝中劑量組（P＜0.05），補腎低劑量組與疏肝低劑量組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各治療組之間BMPRⅡ蛋白表達的比較，疏肝高劑量組最高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)，其余各組表達由高至低依次是疏肝中劑量組、補腎高劑量組、補腎中劑量組、疏肝低劑量組和補腎低劑量組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。各治療組之間AL

21、K5蛋白表達比較，補腎高劑量組最高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其次依次是補腎中劑量組、疏肝中劑量組、補腎低劑量、疏肝高劑量組、疏肝低劑量組。
　　結(jié)論:
　　1逍遙丸和補腎調(diào)經(jīng)方含藥血清可提高體外培養(yǎng)小鼠竇前卵泡的存活數(shù)，且隨著培養(yǎng)時間的延長、卵泡的發(fā)育，兩方提高卵泡成活數(shù)的作用更加顯著。
　　2體外培養(yǎng)小鼠卵母細胞D2、D4、D6過程中，GDF-9、BMPRⅡ、ALK5 mRNA及蛋白表達呈逐漸下降趨勢，提示

22、卵母細胞分泌因子GDF-9及其受體在卵泡發(fā)育初期促進卵母細胞發(fā)育的作用更加明顯。
　　3逍遙丸和補腎調(diào)經(jīng)方對體外培養(yǎng)乳鼠卵母細胞D2、D4、D6過程中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5 mRNA及蛋白表達亦呈逐漸下降趨勢，但兩方均可通過上調(diào)體外培養(yǎng)不同時間點小鼠卵母細胞中GDF-9 mRNA及其蛋白的表達，提高竇前卵泡的成活率。其機制可能是誘導GDF-9與其Ⅱ型受體BMPRⅡ形成復(fù)合物，進而募集Ⅰ型受體ALK5，然后使其發(fā)生磷酸化而

23、活化，活化的ALK5進一步磷酸化細胞內(nèi)的信號因子Smad2、 Smad3、Smad4，進而調(diào)控信號轉(zhuǎn)導。兩方提高卵泡發(fā)育初期卵母細胞質(zhì)量的作用更為明顯。
　　4補腎調(diào)經(jīng)方影響GDF-9信號通路的作用呈劑量依賴性，即高劑量組效果最優(yōu)。
　　5在體外培養(yǎng)小鼠卵泡過程中，疏肝各劑量組上調(diào)GDF-9Ⅱ型受體BMPRⅡ mRNA及蛋白表達的作用優(yōu)于補腎各劑量組，補腎各劑量組上調(diào)Ⅰ型受體ALK5 mRNA及蛋白表達的作用優(yōu)于疏肝各劑量組

24、。補腎高劑量組上調(diào)Smad2/3/4 mRNA及蛋白表達的作用最強。提示補腎法、疏肝法對小鼠體外卵泡發(fā)育過程中卵母細胞GDF-9及其信號通路的作用的環(huán)節(jié)不盡相同，逍遙丸可能主要通過上調(diào)GDF-9Ⅱ型受體BMPRⅡ mRNA及蛋白表達引起對下游信號分子的變化，進而對卵泡發(fā)育發(fā)生調(diào)控作用，補腎調(diào)經(jīng)方可能主要調(diào)控Ⅰ型受體ALK5 mRNA及蛋白表達從而調(diào)控下游信號分子影響卵泡的發(fā)育。
　　6逍遙丸和補腎調(diào)經(jīng)方具有提高卵母細胞質(zhì)量的作用，