補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)體外培養(yǎng)小鼠卵泡發(fā)育過(guò)程中卵母細(xì)胞GDF-9及其Smads信號(hào)通路影響的研究.pdf

1、目的:針對(duì)體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)中妊娠率低、流產(chǎn)率高等問(wèn)題，在前期研究證實(shí)補(bǔ)腎法、疏肝法具有提高臨床妊娠率、改善妊娠結(jié)局、提高卵母細(xì)胞質(zhì)量作用的基礎(chǔ)上，研究補(bǔ)腎法、疏肝法在小鼠體外卵泡發(fā)育過(guò)程中對(duì)卵母細(xì)胞GDF-9及其信號(hào)通路的調(diào)控作用，以探討兩法改善卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用機(jī)制，比較兩法作用機(jī)制及作用環(huán)節(jié)之異同。
　　方法:含藥血清制備:取28只

2、6周齡健康雌性SD大鼠按體重隨機(jī)分為7組:疏肝低劑量組、疏肝中劑量組、疏肝高劑量組、補(bǔ)腎低劑量組、補(bǔ)腎中劑量組、補(bǔ)腎高劑量組、空白組。實(shí)驗(yàn)用逍遙丸為河南宛西制藥股份有限公司生產(chǎn)，將48粒逍遙丸溶于100ml蒸餾水中制成混懸液，混懸液含生藥0.18g/ml。補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方所需藥材一次性購(gòu)自石家莊市樂(lè)仁堂藥店，并由本校中藥系制成口服液，口服藥含生藥1.62g/ml?？瞻讓?duì)照組每日灌服生理鹽水2ml/100g體重;補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方組高、中、低劑量組和疏

3、肝高、中、低劑量組每日灌服補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸3ml/100g體重、2ml/100g體重、1ml/100g體重（分別相當(dāng)于成人劑量的18倍、12倍、6倍，每日分兩次給藥，連續(xù)4天。于末次給藥后1h大鼠股動(dòng)脈采血。室溫靜置2h離心(3000rpm，10min)，取上清，56℃水浴30min滅活補(bǔ)體，0.22μm無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，得補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸低、中、高劑量大鼠含藥血清和正常大鼠血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　選用出生D12昆明乳鼠

4、432只，分3批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每批144只，隨機(jī)分為8組:補(bǔ)腎低劑量組、補(bǔ)腎中劑量組、補(bǔ)腎高劑量組，疏肝低劑量組、疏肝中劑量組、疏肝高劑量組、正常組、空白組，每組18只（3批每組共54只）。
　　分離竇前卵泡:采用機(jī)械法分離。將昆明乳鼠頸椎脫臼處死，取出雙側(cè)卵巢，用含青、鏈霉素各200IU/mL的α-MEM培養(yǎng)液清洗1-2次，在帶有目鏡標(biāo)尺的體視顯微鏡下用針頭對(duì)卵巢進(jìn)行分離，選擇直徑在80-120μm之間的竇前卵泡。
　　竇前卵

5、泡培養(yǎng):35mm培養(yǎng)皿中置2ml培養(yǎng)液，37℃、5％CO2(V/V)、100％濕度培養(yǎng)，24h后卵泡貼壁。分別加入補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸大鼠含藥血清，分為補(bǔ)腎組和疏肝組，補(bǔ)腎含藥血清組與疏肝含藥血清組分別設(shè)置低、中、高三個(gè)劑量組，正常大鼠血清為正常組，不加血清為空白組。培養(yǎng)6d，隔天換液1/2;0.25％膠原酶消化竇前卵泡，分離得卵母細(xì)胞，第一批置于液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆?用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR)。第二批迅速放入2％多聚甲醛中固定（用于

6、免疫組化）。第三批迅速放入2％多聚甲醛固定（用于免疫熒光）。
　　通過(guò)倒置顯微鏡觀察卵泡形態(tài)及成活數(shù);采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表達(dá);采用免疫組化法、免疫熒光法檢測(cè)卵母細(xì)胞中上述指標(biāo)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1卵泡生長(zhǎng)過(guò)程中形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化
　　體外培養(yǎng)第2天，竇前卵泡貼壁，固定于培養(yǎng)皿底，不能移動(dòng);第4天卵泡顆粒細(xì)胞數(shù)目明顯增多，

7、培養(yǎng)皿底平鋪一層細(xì)胞;第6天顆粒細(xì)胞層數(shù)增多，顆粒細(xì)胞越過(guò)卵泡基底膜生長(zhǎng)，卵泡逐漸失去球形的三維結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)變成為煎蛋樣外觀。消化卵泡膜細(xì)胞及顆粒細(xì)胞后，可見(jiàn)卵母細(xì)胞。
　　2空白組、正常組、疏肝及補(bǔ)腎各劑量組竇前卵泡成活數(shù)的比較
　　在卵泡的體外培養(yǎng)過(guò)程中，D2各組卵泡成活數(shù)比較，疏肝高劑量組及補(bǔ)腎高劑量組較其它各組成活數(shù)均有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;D4各組卵泡成活數(shù)比較，疏肝高劑量組、補(bǔ)腎中劑量組及補(bǔ)腎

8、高劑量組較其它各組均有增高趨勢(shì)，其中補(bǔ)腎高劑量組卵泡成活數(shù)較其它各劑量組均增高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在體外培養(yǎng)D6，與空白對(duì)照組比較，正常組卵泡成活數(shù)有增多趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05);與空白對(duì)照組比較，疏肝低、中、高劑量組和補(bǔ)腎低、中、高劑量組的卵泡成活數(shù)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）;與正常組比較，補(bǔ)腎各劑量組和疏肝各劑量組的卵泡成活數(shù)均升高，其中補(bǔ)腎高劑量組卵泡成活數(shù)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

9、5)，其余依次為疏肝中劑量組、疏肝高劑量組、補(bǔ)腎中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;疏肝低劑量組及補(bǔ)腎低劑量組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3各組體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表達(dá)
　　3.1體外培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)各劑量組間GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表達(dá)
　　空白組及正常組:與D2

10、比較，D4、D6 GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)均降低(均P＜0.05)，且D6較D4表達(dá)更低（P＜0.05）。疏肝各劑量組:與D2比較，D4、D6 GDF-9 mRNA表達(dá)均降低(均P＜0.05)，且D6較D4表達(dá)更低(P＜0.05);BMPRⅡ、ALK5mRNA表達(dá)均降低(均P＜0.05)，且D6較D4表達(dá)更低（P＜0.05）;與D2比較，D4、D6 Smad2、Smad3、Sma

11、d4 mRNA表達(dá)有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。補(bǔ)腎各劑量組:與D2比較，D4、D6 GDF-9mRNA表達(dá)均降低(均P＜0.05)，且D6較D4表達(dá)更低(P＜0.05); BMPRⅡ、ALK5 mRNA表達(dá)均降低（P＜0.05），且D6較D4表達(dá)更低（P＜0.05）;D2、D4、D6 Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.2各組之間小鼠卵母細(xì)胞中GDF-9、B

12、MPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表達(dá)
　　在體外培養(yǎng)的D2、D4、D6:
　　正常組較空白組卵母細(xì)胞中GDF9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、 Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)均有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）;
　　與空白組、正常組比較，疏肝低、中、高劑量組卵母細(xì)胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)均升高（均P

13、＜0.05）;且疏肝中劑量組GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)高于疏肝高劑量組及疏肝低劑量組（均P＜0.05）;疏肝高劑量組表達(dá)高于疏肝低劑量組(P＜0.05)。與正常組、空白組比較，補(bǔ)腎低、中、高劑量組的卵母細(xì)胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表達(dá)升高（均P＜0.05）;且補(bǔ)腎高劑量組GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、

14、Smad4 mRNA表達(dá)較補(bǔ)腎中、低劑量組均升高(均P＜0.05)，呈劑量依賴性。
　　疏肝低、中、高劑量組與補(bǔ)腎低、中、高劑量組之間比較，補(bǔ)腎高劑量組卵母細(xì)胞中GDF-9、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表達(dá)高于疏肝中劑量組，其次各組表達(dá)由高至低依次為補(bǔ)腎中劑量組、疏肝高劑量組、補(bǔ)腎低劑量組、疏肝低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各治療組之間ALK5 mRNA表達(dá)比較，補(bǔ)腎高劑量組表達(dá)最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、意義（P＜0.05），其次依次是疏肝中劑量組、補(bǔ)腎中劑量組、補(bǔ)腎低劑量、疏肝高劑量組、疏肝低劑量組。各治療組之間BMPRⅡmRNA表達(dá)比較，疏肝中劑量組表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余依次是疏肝高劑量組、補(bǔ)腎高劑量組、補(bǔ)腎中劑量組、疏肝低劑量組和補(bǔ)腎低劑量組。
　　4各組體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表達(dá)
　　4.1體外培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠卵

16、母細(xì)胞GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表達(dá)
　　空白組及正常組:與D2比較， D4、D6 GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)均降低(均P＜0.05)，且D6較D4表達(dá)更低（P＜0.05）。疏肝各劑量組:與D2比較， D4、D6 GDF-9蛋白表達(dá)均降低(均P＜0.05)，且D6較D4表達(dá)更低(P＜0.05); BMPRⅡ、ALK5、Smad4蛋白表

17、達(dá)均降低(均P＜0.05)，且D6較D4表達(dá)更低（P＜0.05）;與D2比較，D4、D6 Smad2、Smad3蛋白表達(dá)有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　補(bǔ)腎低、中、高劑量組:與D2比較，D4、D6 GDF-9蛋白表達(dá)均降低（均P＜0.05），且D6較D4表達(dá)更低(P＜0.05)。BMPRⅡ、ALK5蛋白表達(dá)均降低(均（P＜0.05)，且D6較D4表達(dá)更低（P＜0.05）。D2、D4、D6Smad2、Smad3

18、、Smad4蛋白表達(dá)有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.2各組之間小鼠卵母細(xì)胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表達(dá)
　　在體外培養(yǎng)的D2、D4、D6:
　　正常組比空白組卵母細(xì)胞中GDF9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)均升高(均P＜0.05)。
　　與空白組、正常組比較，疏肝低、中、高劑量組卵母細(xì)胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5

19、、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)升高（均P＜0.05）;且疏肝高劑量組蛋白表達(dá)最高，其次為疏肝中、低劑量組，呈劑量依賴性。與正常組、空白組比較，補(bǔ)腎低、中、高劑量組的卵母細(xì)胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)升高（均P＜0.05）;且補(bǔ)腎高劑量組蛋白表達(dá)最高，其次為補(bǔ)腎中劑量組和補(bǔ)腎低劑量組，呈劑量依賴性。
　　疏肝低、中、高劑量組與補(bǔ)腎低、中、高劑量組之間比較，補(bǔ)腎高劑量組

20、卵母細(xì)胞中GDF-9、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表達(dá)高于疏肝高劑量組，其次分別為補(bǔ)腎中劑量組、疏肝中劑量組（P＜0.05），補(bǔ)腎低劑量組與疏肝低劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各治療組之間BMPRⅡ蛋白表達(dá)的比較，疏肝高劑量組最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，其余各組表達(dá)由高至低依次是疏肝中劑量組、補(bǔ)腎高劑量組、補(bǔ)腎中劑量組、疏肝低劑量組和補(bǔ)腎低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。各治療組之間AL

21、K5蛋白表達(dá)比較，補(bǔ)腎高劑量組最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其次依次是補(bǔ)腎中劑量組、疏肝中劑量組、補(bǔ)腎低劑量、疏肝高劑量組、疏肝低劑量組。
　　結(jié)論:
　　1逍遙丸和補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清可提高體外培養(yǎng)小鼠竇前卵泡的存活數(shù)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)、卵泡的發(fā)育，兩方提高卵泡成活數(shù)的作用更加顯著。
　　2體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞D2、D4、D6過(guò)程中，GDF-9、BMPRⅡ、ALK5 mRNA及蛋白表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì)，提示

22、卵母細(xì)胞分泌因子GDF-9及其受體在卵泡發(fā)育初期促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育的作用更加明顯。
　　3逍遙丸和補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對(duì)體外培養(yǎng)乳鼠卵母細(xì)胞D2、D4、D6過(guò)程中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5 mRNA及蛋白表達(dá)亦呈逐漸下降趨勢(shì)，但兩方均可通過(guò)上調(diào)體外培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)小鼠卵母細(xì)胞中GDF-9 mRNA及其蛋白的表達(dá)，提高竇前卵泡的成活率。其機(jī)制可能是誘導(dǎo)GDF-9與其Ⅱ型受體BMPRⅡ形成復(fù)合物，進(jìn)而募集Ⅰ型受體ALK5，然后使其發(fā)生磷酸化而

23、活化，活化的ALK5進(jìn)一步磷酸化細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)因子Smad2、 Smad3、Smad4，進(jìn)而調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。兩方提高卵泡發(fā)育初期卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用更為明顯。
　　4補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方影響GDF-9信號(hào)通路的作用呈劑量依賴性，即高劑量組效果最優(yōu)。
　　5在體外培養(yǎng)小鼠卵泡過(guò)程中，疏肝各劑量組上調(diào)GDF-9Ⅱ型受體BMPRⅡ mRNA及蛋白表達(dá)的作用優(yōu)于補(bǔ)腎各劑量組，補(bǔ)腎各劑量組上調(diào)Ⅰ型受體ALK5 mRNA及蛋白表達(dá)的作用優(yōu)于疏肝各劑量組

24、。補(bǔ)腎高劑量組上調(diào)Smad2/3/4 mRNA及蛋白表達(dá)的作用最強(qiáng)。提示補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)小鼠體外卵泡發(fā)育過(guò)程中卵母細(xì)胞GDF-9及其信號(hào)通路的作用的環(huán)節(jié)不盡相同，逍遙丸可能主要通過(guò)上調(diào)GDF-9Ⅱ型受體BMPRⅡ mRNA及蛋白表達(dá)引起對(duì)下游信號(hào)分子的變化，進(jìn)而對(duì)卵泡發(fā)育發(fā)生調(diào)控作用，補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可能主要調(diào)控Ⅰ型受體ALK5 mRNA及蛋白表達(dá)從而調(diào)控下游信號(hào)分子影響卵泡的發(fā)育。
　　6逍遙丸和補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方具有提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用，